斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)ORF6基因“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建與免疫效果研究.pdf

1、本研究構(gòu)建了斑點(diǎn)叉尾鮰傳統(tǒng)DNA疫苗和“自殺性”DNA疫苗，鑒定檢測(cè)了兩者在細(xì)胞中的表達(dá)差異，并對(duì)兩種疫苗的免疫效果進(jìn)行了比較。
　　 1．斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(Channel CatfishVirus，CCV)“自殺性”DNA疫苗的構(gòu)建根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)ORF6基因序列，設(shè)計(jì)合適的引物，擴(kuò)增ORF6基因，分別將其克隆到“自殺性”DNA疫苗載體pSFV與常規(guī)DNA疫苗載體pcDNA3.1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后提取質(zhì)粒，構(gòu)

2、建“自殺性”DNA疫苗ps-ORF6與常規(guī)DNA疫苗pcd-ORF6，利用轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌菌液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、提取質(zhì)粒酶切以及序列測(cè)定等方法證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。
　　 2．CCV ORF6基因在細(xì)胞中的表達(dá)將待驗(yàn)證的表達(dá)CCV ORF6基因的“自殺性”DNA疫苗和常規(guī)DNA疫苗重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞），間接免疫熒光試驗(yàn)表明ORF6基因在細(xì)胞中均獲得表達(dá)，但“自殺性”DNA疫苗表達(dá)載體的表達(dá)量顯著低于常規(guī)

3、DNA疫苗表達(dá)載體。
　　 3．CCV“自殺性”DNA疫苗對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰免疫指標(biāo)的影響用構(gòu)建的“自殺性”DNA疫苗ps-ORF6（Ⅲ組）與常規(guī)DNA疫苗pcd-ORF6(Ⅳ組)兩種質(zhì)粒制作的疫苗及對(duì)照的另外三種免疫劑(Ⅰ組為“自殺性”空載體pSFV制成、Ⅱ組為常規(guī)載體pcDNA3.1(+)制成、Ⅴ組為緩沖液PBS)免疫80±10g的斑點(diǎn)叉尾鮰，分別在第0周、第2周、第4周、第6周、第8周等不同時(shí)間取血檢測(cè)血液白細(xì)胞吞噬活性、血清溶

4、菌酶活性、血液總蛋白含量等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析如下：(1)CCV“自殺性”DNA疫苗引起的白細(xì)胞吞噬活性較對(duì)照組有顯著性差異(P＜0.05)，均高于其它對(duì)照組。表明CCV“自殺性”DNA疫苗能夠更好地增強(qiáng)魚(yú)體白細(xì)胞吞噬活性，增強(qiáng)免疫力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，影響斑點(diǎn)叉尾鮰白細(xì)胞吞噬活性的因素較多，實(shí)驗(yàn)各組都有所增強(qiáng)。(2)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組血清溶菌酶含量比V組高，其中Ⅲ組和Ⅳ組顯著高于其它組別（P＜0.05），同時(shí)，Ⅲ組顯著高于Ⅳ組(P＜0.

5、05)。表明CCV“自殺性”DNA疫苗能夠有效地提高斑點(diǎn)叉尾鮰血清溶菌酶含量。(3)各實(shí)驗(yàn)組均能引起斑點(diǎn)叉尾鮰血清蛋白含量的增加，但是從組間存在顯著性差異來(lái)看，CCV“自殺性”DNA疫苗相對(duì)其它組沒(méi)有明顯的優(yōu)勢(shì)，其結(jié)果可能受到外界的影響與免疫試劑的影響有交叉共同作用。
　　 4．CCV“自殺性”DNA疫苗對(duì)生長(zhǎng)的影響。
　　 統(tǒng)計(jì)免疫后各組斑點(diǎn)叉尾鮰的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)各組生長(zhǎng)情況良好，組間差異不顯著，表明各組免疫劑對(duì)斑點(diǎn)叉