斑點(diǎn)叉尾鮰Il-8基因的克隆、表達(dá)及疫苗佐劑效應(yīng)研究.pdf

1、漁用疫苗接種因其可有效地預(yù)防水產(chǎn)動(dòng)物疾病，又能避免抗生素等藥物對(duì)水環(huán)境和水產(chǎn)品本身造成的污染，已成為國際上水產(chǎn)疫病防控的主流技術(shù)。免疫佐劑是指結(jié)構(gòu)多樣具有調(diào)節(jié)疫苗抗原固有免疫原性屬性的物質(zhì)。細(xì)胞因子是機(jī)體的自身成分，作為佐劑，相比傳統(tǒng)佐劑具有更多優(yōu)勢(shì)。IL-8是由多種細(xì)胞產(chǎn)生具有趨化屬性的細(xì)胞因子，它能促進(jìn)局部的炎癥反應(yīng)，趨化T細(xì)胞和調(diào)節(jié)其細(xì)胞因子的產(chǎn)生。研究表明，IL-8作為細(xì)胞因子佐劑對(duì)疫苗具有免疫增強(qiáng)作用，可顯著增強(qiáng)疫苗的免疫保護(hù)

2、效力。本文以斑點(diǎn)叉尾鮰源IL-8作為細(xì)胞因子佐劑來驗(yàn)證其能否增強(qiáng)斑點(diǎn)叉尾鮰源海豚鏈球菌疫苗的免疫效力。具體內(nèi)容包括:
　　1.斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8基因的克隆及分子特性分析
　　采用RT-PCR法從斑點(diǎn)叉尾鮰脾臟中擴(kuò)增出IL-8(CcIL-8)基因，并將CcIL-8片段克隆到pMD19-T載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。應(yīng)用生物信息學(xué)工具對(duì)該基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分子特性分析。結(jié)果表明:CcIL-8全長336 bp，包含

3、一個(gè)完整的開放閱讀框，編碼111個(gè)氨基酸，含有CXC型趨化因子保守結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽;存在跨膜區(qū);含有2個(gè)潛在的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)和2個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn);二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和β-折疊組成;氨基酸序列分析表明本研究得到的是斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8短的可變轉(zhuǎn)錄本，該氨基酸與印度囊鰓鯰（Heteropneustes fossils）IL-8氨基酸的一致性高達(dá)87.1％，進(jìn)化樹上聚為一簇，親緣關(guān)系較近，與鯉魚、斑馬魚和虹鱒等硬骨魚類親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。<

4、br>　　2.斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8成熟肽基因的原核表達(dá)及其作為海豚鏈球菌亞單位疫苗免疫佐劑的效果評(píng)價(jià)
　　參照已克隆的CcIL-8序列設(shè)計(jì)去信號(hào)肽引物，克隆到斑點(diǎn)叉尾鮰成熟肽（mCcIL-8）基因，全長264 bp。將成熟肽基因與pET-32a(+)載體連接，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-32a(+)-mCcIL-8，并于表達(dá)菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，成功表達(dá)大小約為29 kDa的重組斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8成熟（重組mCcIL-8）蛋白

5、。經(jīng)過Ni-NTA親和層析純化以及梯度透析復(fù)性后，Western-blot和SDS-PAGE檢測(cè)分別表明重組蛋白融合表達(dá)成功以及該蛋白已純化為單一條帶。為驗(yàn)證純化復(fù)性的重組mCcIL-8(rmCcIL-8)蛋白是否具有免疫佐劑效應(yīng)，將重組mCcIL-8蛋白(20μg/尾)與海豚鏈球菌亞單位疫苗S.iniae-rENO（50μg/尾）混合腹腔注射免疫斑點(diǎn)叉尾鮰（80±10 g），同時(shí)以重組mCcIL-8蛋白為蛋白佐劑對(duì)照組、S.iniae

6、-rENO為疫苗對(duì)照組和PBS為陰性對(duì)照組。(1)血清非特異性免疫指標(biāo):于免疫后的第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性這兩個(gè)非特異性免疫指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果:與S.iniae-rENO組相比，S.iniae-rENO+rmCcIL-8組溶菌酶活力于免疫后第1、3和7d得到極顯著(P＜0.01)增強(qiáng)，第14d時(shí)兩疫苗組無顯著差異，但均極顯著(P＜0.01)高于蛋白佐劑對(duì)照組和

7、陰性對(duì)照組，第21d后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組溶菌酶活力無顯著差異;ACH50活性于免疫后第1和3d得到顯著(P＜0.05)增強(qiáng)，第7和14d時(shí)兩疫苗組無顯著差異，但均極顯著(P＜0.01)高于蛋白佐劑對(duì)照組和陰性對(duì)照組，第21d后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組ACH50活性無顯著差異。表明:重組mCcIL-8蛋白能夠在一定時(shí)間內(nèi)增強(qiáng)亞單位疫苗S.iniae-rENO誘導(dǎo)的溶菌酶和ACH50水平。(2)血清ELISA抗體:于免疫后第7、14、21、28、35

8、、42和56 d采血液，收集血清，采用間接ELISA法檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰血清中抗rENO抗體水平。結(jié)果:在免疫后第14 d檢測(cè)到疫苗組出現(xiàn)特異性抗體;S.iniae-rENO+rmCcIL-8組在第14d到42 d的抗體水平顯著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO組，并于第28 d達(dá)到峰值，第35 d抗體水平下降;第56 d疫苗組均未能檢測(cè)到特異性抗體。表明:重組mCcIL-8蛋白能提高亞單位疫苗S.iniae-rENO的抗體水平，

9、但是未能延長抗體產(chǎn)生的持續(xù)時(shí)間。(3)免疫相關(guān)基因的表達(dá):于免疫后第28 d進(jìn)行攻毒試驗(yàn)的24 h后收集疫苗組和陰性對(duì)照組的頭腎組織，采用qRT-PCR檢測(cè)各組試驗(yàn)魚免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:S.iniae-rENO+rmCcIL-8組試驗(yàn)魚的IL-1β、TNF-α、CXCL10和MHCⅡβ等基因的相對(duì)表達(dá)量顯著(P＜0.05)高于S.iniae-rENO組。表明:重組mCcIL-8蛋白促使亞單位疫苗S.iniae-rENO產(chǎn)生更

10、強(qiáng)的免疫反應(yīng)和MHCⅡ類抗原提呈反應(yīng)。(4)攻毒保護(hù)率:于免疫后第28和56 d分別進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)兩次攻毒后各組的死亡率及疫苗組的保護(hù)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:第一次攻毒后，S.iniae-rENO+rmCcIL-8組的相對(duì)免疫保護(hù)率(71.42％)明顯高于S.iniae-rENO組(49.99％)，但是第二次攻毒后，兩種疫苗均無較好的免疫保護(hù)力。表明:亞單位疫苗S.iniae-rENO+rmCcIL-8能誘導(dǎo)魚體產(chǎn)生更強(qiáng)的保護(hù)免疫力，重組m

11、CcIL-8蛋白能增強(qiáng)亞單位疫苗S.iniae-rENO的免疫保護(hù)效力，但未能延長該疫苗的保護(hù)時(shí)間。
　　3.斑點(diǎn)叉尾鮰IL-8基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其作為海豚鏈球菌DNA疫苗免疫佐劑的效果評(píng)價(jià)
　　將含Kozak和6×CAC標(biāo)簽序列的CcIL-8(MCcIL-8)基因克隆至pcDNA3.1(+)真核表達(dá)載體中，成功構(gòu)建真核重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-MCcIL-8(pc-MCcIL-8)，從RNA水平上，通過RT

12、-PCR法檢測(cè)到肌肉注射pc-MCcIL-8的第7、14、28和56 d后均有MCcIL-8基因的轉(zhuǎn)錄;從蛋白質(zhì)水平上，通過免疫組織化學(xué)檢測(cè)到MCcIL-8蛋白在斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉組織中的表達(dá)。為驗(yàn)證pc-MCcIL-8質(zhì)粒DNA是否具有免疫佐劑效應(yīng)，將pc-MCcIL-8(25μg/尾)與海豚鏈球菌DNA疫苗pcDNA3.1(+)S.iniae-eno(pc-Sieno，25μg/尾)混合肌肉注射免疫斑點(diǎn)叉尾鮰(80±10g)，同時(shí)設(shè)基因

13、佐劑對(duì)照組pc-MCcIL-8、DNA疫苗對(duì)照組pc-Sieno和空載體對(duì)照組pcDNA3.1(+)(pc)。(1)血清非特異性免疫指標(biāo):于免疫后第1、3、7、14、21、28和56 d采血液，收集血清，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰血清中溶菌酶活力和ACH50活性這兩個(gè)非特異性免疫指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8組溶菌酶活力于免疫后第3～56 d均顯著(P＜0.05)高于pc-Sieno組，并于第21 d達(dá)到峰值;ACH50活

14、性于免疫后第3～56 d均極顯著(P＜0.01)高于pc-Sieno組，并于第14d達(dá)到峰值。表明:pc-MCcIL-8能增強(qiáng)DNA疫苗pc-Sieno刺激魚體產(chǎn)生溶菌酶和ACH50的水平;(2)血清ELISA抗體:于免疫后第7、14、21、28、35、42和56 d采血液，收集血清，采用間接ELISA法檢測(cè)斑點(diǎn)叉尾鮰血清中抗ENO抗體水平。結(jié)果:在免疫后第14～56 d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，pc-Sieno+pc-MCcIL-8組抗體水平極顯著

15、(P＜0.01)高于pc-Sieno組，并于第35 d達(dá)到峰值。表明:pc-MCcIL-8能明顯提高DNA疫苗pc-Sieno刺激斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)生的抗體水平。(3)免疫相關(guān)基因的表達(dá):于免疫后第28 d進(jìn)行攻毒試驗(yàn)的24 h后收集疫苗組和空載體對(duì)照組的頭腎組織，qRT-PCR檢測(cè)各組試驗(yàn)魚免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果:pc-MCcIL-8能促進(jìn)DNA疫苗極顯著(P＜0.01)上調(diào)IL-1β和CXCL10以及顯著(P＜0.05)上調(diào)TNF

16、-α和MHCⅡβ的相對(duì)表達(dá)量。表明:pc-MCcIL-8可能通過誘導(dǎo)IL-1β和TNF-α等細(xì)胞因子的分泌促進(jìn)免疫反應(yīng)以及增強(qiáng)MHCⅡ類抗原提呈反應(yīng)而發(fā)揮佐劑效應(yīng);(4)攻毒保護(hù)率:于免疫后第28和56 d分別進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，對(duì)兩次攻毒后各組的死亡率及疫苗組的保護(hù)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果:pc-Sieno+pc-MCcIL-8組（80％和73.33％）兩次攻毒的相對(duì)免疫保護(hù)率均明顯高于pc-Sieno組（60％和53.33％）。表明:pc-Sie