小鼠第一極體(PB1)重組卵母細(xì)胞去精核孤雌發(fā)育研究.pdf

1、西南大學(xué)碩士學(xué)位論文小鼠第一極體（PB1）重組卵母細(xì)胞去精核孤雌發(fā)育研究姓名：王建華申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：細(xì)胞生物學(xué)指導(dǎo)教師：李躍民20090501兩南大學(xué)碩十等：何論文曼曼皇曼!!曼!皇曼曼!曼!!曼曼曼曼曼曼!曼!曼曼曼曼烹!!!!曼!!苧苧!!蔓曼曼鼉曼皇曼!皇苧!!曼曼烹皇曼曼!曼曼苧!曼曼舅鼉曼曼曼鼉皇堂nnn鼉曼曼本研究根據(jù)以上設(shè)計(jì)，首先對(duì)人為可控PBl排出的確切時(shí)間段和批量獲取高活性PBl的簡(jiǎn)易方法進(jìn)行了研究；通過(guò)卵母細(xì)

2、胞的去核、移入極體和體外受精等方法觀察PBl移入后形成雌原核的情況和受精卵裂發(fā)育情況；在此基礎(chǔ)上將PBl移入成熟的沒(méi)有去核的卵母細(xì)胞后，進(jìn)行體外受精，在雌雄原核形成后去除雄原核，研究觀察含有PBI雜合二倍染色體卵母細(xì)胞的孤雌發(fā)育和胚胎卵裂情況。本研究集核移植技術(shù)、體外受精技術(shù)、卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)技術(shù)、孤雌激活和核型分析技術(shù)等多種胚胎工程上游技術(shù)于一體，研究探索了含有PBl新型雜合二倍體孤雌胚胎的牛成途徑和影響提高其生成效率的因素。試驗(yàn)總結(jié)

3、如下：1人工控制PBl排出時(shí)間研究本試驗(yàn)用孕馬血清(PMSG)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)對(duì)68周齡的雌性昆明系小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵處理。從注射hCG后10h開(kāi)始每隔1h取一組小鼠(每組3只小鼠)，從輸卵管內(nèi)收集卵母細(xì)胞卵丘細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，用適當(dāng)濃度的透明質(zhì)酸酶處理，脫去卵丘細(xì)胞，觀察卵母細(xì)胞的數(shù)量乖]PBl形態(tài)，并根據(jù)本實(shí)驗(yàn)自制的一套極體分級(jí)圖(見(jiàn)圖31)進(jìn)行分級(jí)，以確定剛剛排出PBl卵母細(xì)胞的最佳采集時(shí)間。結(jié)果表明：在相同的超

4、排處理過(guò)程中，注射hCG后12h、13h茅D14h得到的l、II級(jí)PBl率較高，其中12h最高(6087％)，且三者之間差異不顯著(PO05)，12h與11h和14h以后其他各組相比均差異顯著(PO，05)。結(jié)果顯示：hCG注射后12h所收集到的含PBl的卵母細(xì)胞，為剛剛排出極體從卵巢排出進(jìn)入輸卵管的新鮮卵母細(xì)胞，在進(jìn)行極體重組實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)選擇此時(shí)的卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞中的PBl為試驗(yàn)材料。2囪‘效收集高活性PBl的研究本試驗(yàn)采用不同濃度的鏈

5、蛋白酶(15％、1％、05％)于不同作用時(shí)間對(duì)含有PBl的卵母細(xì)胞進(jìn)行去除透明帶處理，對(duì)分離出來(lái)的PBl采用臺(tái)盼藍(lán)染色，以篩選出適合本試驗(yàn)條件去除透明帶分離出高活性PBl的有效方法。試驗(yàn)結(jié)果表明：處理組3(1％，5min)所獲得的高活性PBl率均高于其他各處理組，達(dá)到了8000％，且與其他處理組差異顯著(P005)；其他各組除了處理組2(05％，8min)和處理組5(15％，5min)差異不顯著外差異均顯著(PO05)。因此在進(jìn)行以PB