MKlp2與profilin1對小鼠卵母細胞極體排出的調(diào)控作用.pdf

1、哺乳動物生命起源的一個重要基礎(chǔ)的過程就是卵母細胞的成熟，這也是多年來科學研究的一個熱點。卵母細胞的成熟涉及多個復雜的細胞內(nèi)過程，其中，細胞骨架，包括微管和微絲在內(nèi)，它們的組裝以及動態(tài)變化對于卵母細胞的成熟極為重要。細胞骨架任意一部分受到任何的破壞都有可能導致卵母細胞成熟的失敗或是異常，甚至后續(xù)的受精卵以及胚胎發(fā)育都會受到影響，進而導致嬰兒的缺陷及畸形。然而，涉及到微絲以及微管的調(diào)控機制，目前的研究還不能完全解釋清楚。因此，進一步研究卵母

2、細胞成熟過程中的分子調(diào)控機制，對于完善人類對于哺乳動物生殖機理的理解，促進家畜繁殖的調(diào)控甚至人類的生殖健康都有著深遠的意義。
　　本試驗以小鼠為研究對象，采用體外培養(yǎng)、抑制劑處理、嗎啉代(morpholino，MO)注射、活細胞觀察、免疫熒光染色和激光共聚焦及免疫蛋白印跡等方法，研究相關(guān)分子在小鼠卵母細胞成熟過程中的調(diào)控作用。先用免疫熒光染色法檢測MKlp2和profilin1兩種蛋白在小鼠卵母細胞成熟過程中的表達與定位，再分別通

3、過蛋白特異性抑制劑處理或嗎啉代(morpholino，MO)注射技術(shù)，破壞蛋白的活性或者功能，進而研究這兩種蛋白對于卵母細胞成熟過程中相關(guān)過程包括紡錘體裝配、染色體排列以及微絲的組裝的影響，最終了解它們對卵母細胞極體排出的調(diào)控作用。此外，用蛋白免疫印跡(western blot)技術(shù)，檢測敲低profilin1后對微絲以及相關(guān)調(diào)控蛋白表達的影響，進一步揭示profilin1調(diào)控小鼠卵母細胞減數(shù)分裂成熟可能的分子機制，為完善哺乳動物卵母細

4、胞調(diào)控機制提供重要證據(jù)。本研究共分2個部分，主要研究結(jié)果如下:
　　試驗一、MKlp2蛋白抑制劑paprotrain影響小鼠卵母細胞成熟過程中的極體排出哺乳動物卵母細胞的減數(shù)分裂成熟過程中涉及一系列的重要過程，包括紡錘體的組裝和遷移，皮質(zhì)重組，以及極體的排出。這些過程由很多蛋白調(diào)控，但是，MKlp2(有絲分裂類驅(qū)動蛋白2;又稱KIF20A)，一個調(diào)控有絲分裂胞質(zhì)分裂的微管結(jié)合蛋白，是否參與到卵母細胞成熟過程中我們尚不清楚。本實驗就

5、MKlp2在小鼠卵母細胞中的功能展開了試驗研究，免疫熒光染色結(jié)果顯示，MKlp2定位在卵母細胞中的微管上;活細胞觀察發(fā)現(xiàn)用MKlp2的抑制劑破壞MKlp2的活性，導致第一極體排出的失敗，并且能夠在新鮮的培養(yǎng)液中恢復;細胞周期的分析結(jié)果顯示大多數(shù)卵母細胞停滯在中期或者末期;但是，經(jīng)過抑制劑的處理，卵母細胞的紡錘體結(jié)構(gòu)和染色體的排列并沒有遭到破壞。因此，本試驗證明了MKlp2通過調(diào)控第一極體排出來作用于小鼠卵母細胞的成熟。
　　試驗二

6、、Profilin1在小鼠卵母細胞中微絲介導的極體排出過程中的反饋調(diào)控作用作為一個小的微絲綁定蛋白，profilin1在微絲組裝過程中起著很重要的作用。但是，profilin1在哺乳動物卵母細胞中的功能尚不清楚，為了研究profilin1在卵母細胞中的功能，我們首先使用了免疫熒光染色來檢測profilin1的定位。結(jié)果顯示，profilin1定位在減數(shù)分裂紡錘體的周圍，并且和胞質(zhì)中的微絲共定位。通過注射特異性的嗎啉代來敲低profili