通用stem-loop引物方法篩查和定量檢測(cè)免疫抑制患者的microRNA.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:
  RT-qPCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于microRNA(miRNA)表達(dá)定量,其中stem-loop RT-PCR技術(shù)使用最為頻繁,但是該方法耗時(shí)耗試劑,并且不利于快速篩選miRNA。因此我們欲建立一種能快速篩選和定量miRNA的新方法。
  方法:
  1、本論文建立了一種新的稱為“通用stem-loop引物”(USLP)方法,該方法將傳統(tǒng)stem-loop(TSLP)的3'端的特異性片段替換成8個(gè)隨機(jī)堿基,使其能

2、快速篩選和定量miRNA。
  2、設(shè)計(jì)了三個(gè)實(shí)驗(yàn)測(cè)試USLP方法的敏感性、特異性和重復(fù)性;
  1)將合成的miR-155標(biāo)準(zhǔn)品十倍梯度稀釋7個(gè)數(shù)量級(jí)(109-103拷貝/μL),并將稀釋后的不同濃度的miR-155作為模板進(jìn)行qRT-PCR以觀測(cè)方法的敏感性;
  2)將PCR產(chǎn)物通過3%瓊脂糖凝膠電泳、溶解曲線和測(cè)序三種方法共同驗(yàn)證USLP方法的特異性;
  3)選取3個(gè)濃度梯度的合成miR-155標(biāo)準(zhǔn)品(

3、108-106拷貝/μL)進(jìn)行qRT-PCR重復(fù)實(shí)驗(yàn)二十次,用以驗(yàn)證新方法的重復(fù)性;
  3、將29例健康體檢和58例服用FK506(免疫抑制劑)的腎移植患者的T淋巴細(xì)胞激活培養(yǎng),通過比較USLP和TSLP兩方法在T淋巴細(xì)胞激活的不同時(shí)間段(0h、24h、48h和72h)的miRNA表達(dá)變化,來判斷新方法的實(shí)際應(yīng)用情況。
  結(jié)果:
  1、通過使用Primer5軟件成功設(shè)計(jì)用于RT的通用stem-loop引物、以及相

4、應(yīng)的qPCR引物,包括特異性的正向引物和通用反向引物。
  2、USLP方法的敏感性、特異性和重復(fù)性結(jié)果:
  1)敏感性:最低可以檢測(cè)到103拷貝/μL的模板RNA。
  2)特異性:通過分析溶解曲線、瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序結(jié)果,可以得出USLP和TSLP方法的PCR后產(chǎn)物單一且為目的產(chǎn)物。
  3)重復(fù)性:CV值<2.5%,說明USLP方法的高重復(fù)性。
  3、健康體檢和服用FK506的腎移植患者外周血的

5、T淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)不同階段的miRNA表達(dá)變化:
  1)使用USLP方法發(fā)現(xiàn),miR-150-5p(miR-150)和miR-155-5p(miR-155)隨著T淋巴細(xì)胞刺激培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)表達(dá)變化:miR-150在72h時(shí)表達(dá)降到最低,降低了約10倍;miR-155在72h時(shí)表達(dá)升高到最高,升高近7倍。
  2) USLP檢測(cè)在T細(xì)胞激活過程中miR-150與miR-155表達(dá)變化趨勢(shì)與TSLP方法一致。
  3)

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