SPARC基因過表達(dá)對卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一章 SPARC慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定
　　目的:本研究通過構(gòu)建富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(secreted proteinacidic and rich in cysteine，SPARC)基因的慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）并進(jìn)行表達(dá)鑒定，為研究SPARC蛋白功能及作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。
　　方法:采用PCR技術(shù)擴(kuò)增出基因全長，克隆至pLV-

2、EGFP載體質(zhì)粒，測序鑒定后，將重組慢病毒質(zhì)粒按比例與包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞系包裝病毒，病毒液感染SKOV3-PM4細(xì)胞，嘌呤霉素篩選，Real-time PCR和Western印跡驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后基因和蛋白表達(dá)情況，激光共聚焦免疫熒光進(jìn)行蛋白的細(xì)胞定位。
　　結(jié)果:重組載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生重組病毒，目的基因SPARC被重組慢病毒高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞并穩(wěn)定表達(dá);Real-time PCR結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染目的基因組與對

3、照組相比較顯著上調(diào)其mRNA表達(dá)水平(P＜0.05)，Western印跡驗(yàn)證蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05);細(xì)胞免疫熒光結(jié)果表明:SPARC蛋白存在于核周及胞質(zhì)。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了SPARC慢病毒表達(dá)系統(tǒng)，將外源基因SPARC轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶細(xì)胞上調(diào)其表達(dá)，為探討SPARC基因在卵巢惡性腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　第二章 SPARC基因?qū)β殉舶┝馨徒Y(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞SKOV3-PM4增殖、轉(zhuǎn)移的影響

4、>　　目的:探討SPARC基因過表達(dá)對卵巢癌淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）增殖、轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　方法:本研究通過細(xì)胞計(jì)數(shù)法和集落形成實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞的生長、增殖能力;流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室測定細(xì)胞體外遷移、侵襲能力。
　　結(jié)果:生長曲線、集落形成實(shí)驗(yàn)顯示:過表達(dá)SPARC基因后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示各期改變無明顯差異;體

5、外遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)SPARC基因后SKOV3-PM4細(xì)胞遷移、侵襲能力降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:過表達(dá)SPARC基因?qū)α馨徒Y(jié)高轉(zhuǎn)移的上皮性卵巢癌細(xì)胞有一定的抑制作用，可能發(fā)揮抑癌基因的生物學(xué)作用。
　　第三章 SPARC基因?qū)β殉舶┝馨徒Y(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞SKOV3-PM4中VEGF家族信號(hào)通路的影響
　　目的:探討SPARC基因過表達(dá)對卵巢癌細(xì)胞淋巴結(jié)高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的VEGF家族信號(hào)通路的影

6、響，為研究干預(yù)卵巢癌淋巴轉(zhuǎn)移的新方法提供理論依據(jù)。
　　方法:應(yīng)用Western印跡方法驗(yàn)證過表達(dá)SPARC基因后細(xì)胞中VEGF家族信號(hào)通路重要組分蛋白(VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、PIGF)的表達(dá);免疫組化方法檢測裸鼠移植瘤及卵巢惡性腫瘤組織SPARC蛋白的表達(dá)情況，并探討SPARC與VEGF-C、VEGF-D和新生淋巴管(LVD)、新生血管(MVD)的相關(guān)性。
　　結(jié)果:過表達(dá)S

7、PARC基因后，SKOV3-PM4細(xì)胞的VEGF-D、PIGF蛋白表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;免疫組化結(jié)果顯示，SPARC蛋白在有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的卵巢惡性腫瘤組織陽性表達(dá)率分別為15.00％和48.15％(P＜0.05);裸鼠移植瘤組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;卵巢惡性腫瘤組織中，SPARC蛋白與VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)呈反比（P＜0.05），且隨著SPARC蛋白表達(dá)的減少，LVD、MVD增多(