B7-H4基因?qū)β殉舶┘?xì)胞生物學(xué)習(xí)性影響的研究.pdf

1、目的：研究在無(wú)免疫因素情況下，B7-H4基因?qū)β殉舶┘?xì)胞SKOV3生物學(xué)習(xí)性的影響；探討卵巢癌細(xì)胞B7-H4基因高表達(dá)對(duì)靶向誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞殺傷作用的影響。 方法：從人卵巢漿液性囊腺癌組織中提取總RNA，通過(guò)RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增B7-H4核心序列，構(gòu)建B7-H4真核表達(dá)載體PEGFP-N1/B7-H4，以空質(zhì)粒PEGFP-NI作為陰性對(duì)照，分別轉(zhuǎn)染至人上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3篩選獲得穩(wěn)定克隆，分別命名為SKOV3/B7-H4

2、、SKOV3/neo。通過(guò)RT-PCR、熒光技術(shù)分別進(jìn)行mRNA及蛋白水平的鑒定。實(shí)驗(yàn)分成實(shí)驗(yàn)組（SKOV3/B7-H4組）、陰性對(duì)照組（SKOV3/neo組）和空白對(duì)照組（SKOV3組），通過(guò)MIT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀細(xì)胞周期和凋亡測(cè)定、集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在無(wú)免疫因素情況下B7-H4對(duì)卵巢癌細(xì)胞的影響。利用免疫磁珠分離法（MACS）分離純化臍血CD34+細(xì)胞并在體外誘導(dǎo)分化為DC，用反

3、復(fù)凍融法從SKOV3中提取可溶性凍融抗原并負(fù)載DC誘導(dǎo)生成CTL。MTT法檢測(cè)CTL細(xì)胞對(duì)三組細(xì)胞的殺傷作用。 結(jié)果： （1）成功構(gòu)建了B7-H4基因真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定表達(dá)B7-H4蛋白細(xì)胞株SKOV3/B7-H4及陰性對(duì)照組細(xì)胞株SKOV3/neo。三組細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)組B7-H4mRNA表達(dá)陽(yáng)性，融合蛋白定位于細(xì)胞膜上，空白對(duì)照組及陰性對(duì)照均無(wú)B7-H4mRNA及蛋白的表達(dá)。細(xì)胞形態(tài)、核漿比例、排列方式無(wú)明顯改變。

4、 （2）通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，培養(yǎng)48h后，實(shí)驗(yàn)組積分吸光度分別與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；三組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示，實(shí)驗(yàn)組明顯快于陰性及空白對(duì)照組。 （3）實(shí)驗(yàn)組集落形成數(shù)為15.25±7.27個(gè)，與陰性對(duì)照組（13.50±7.55個(gè)）及空白對(duì)照組（13.75±8.73個(gè)）集落形成數(shù)兩兩比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），

5、但實(shí)驗(yàn)組集落形成直徑大，細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞排列較緊密。 （4）檢測(cè)三組細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)組G2/M期細(xì)胞百分比為20.3±2.1，高于陰性對(duì)照組（13.2±1.4），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組（14.5±0.6）比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。凋亡檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組凋亡細(xì)胞數(shù)百分比為6.33±1.21，低于陰性對(duì)照組（10.50±2.88），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組（1

6、0.17±3.13）無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。 （5）在劃痕實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞劃痕距離明顯縮短，與陰性對(duì)照及空白對(duì)照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 （6）侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，穿膜細(xì)胞數(shù)實(shí)驗(yàn)組為47.00±15.90個(gè)，明顯高于陰性對(duì)照組（26.88±12.99個(gè)）及空白對(duì)照組（28.90±12.94個(gè)），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 （7）靶向誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞殺傷率明顯低于陰性對(duì)照組（20