鸚鵡熱衣原體毒力相關(guān)CT135同源基因的致病機(jī)制研究.pdf

1、鸚鵡熱衣原體（Chlamydia psittaci，Cps）是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生、具有獨(dú)特二相發(fā)育周期的人獸共患病原菌。根據(jù)最新分類方法，Cps歸類到衣原體屬、衣原體科、衣原體目。20世紀(jì)30年代Cps曾在12個(gè)國家發(fā)生大流行，特別是1930年美國馬里蘭州的Cps疫情直接促使了美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)的成立。Cps廣泛感染動(dòng)物，可導(dǎo)致流產(chǎn)、關(guān)節(jié)炎等疾病，人類不是Cps的天然宿主，可因吸入分泌物或與鳥類的密切接觸而感染，引起肺炎等疾病

2、，稱為鸚鵡熱。其傳播途徑廣泛，人類可通過氣溶膠、皮膚、粘膜、眼結(jié)膜和傷口等引起感染，重癥感染可出現(xiàn)全身中毒癥狀、急性腎功能衰竭、胰腺炎等，甚至死亡。由于易通過氣溶膠-呼吸道途徑傳播和高致病性，Cps是被列入國際《禁止生物武器公約》的經(jīng)典生物戰(zhàn)劑和生物恐怖劑。
　　由于培養(yǎng)純化困難、對(duì)生物安全條件要求高、屬生物恐怖劑范疇等原因，國內(nèi)外只有極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室從事Cps基礎(chǔ)研究。國內(nèi)外目前還沒有Cps特有毒力基因的報(bào)道，對(duì)Cps致病機(jī)制的理解

3、主要來自對(duì)其它衣原體種特別是沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)的研究。Ct是沙眼和最常見的性傳播疾病的病原體。本課題研究對(duì)象是Cps的CT135同源基因，這是因?yàn)镃T135是新發(fā)現(xiàn)的Ct毒力基因，有三個(gè)表型:(1)在未經(jīng)體外培養(yǎng)的臨床樣本中，CT135基因是完整的;(2)具有完整CT135基因的Ct在細(xì)胞上連續(xù)傳代時(shí)，會(huì)自然發(fā)生無義突變并獲得生長優(yōu)勢(shì);(3)不可思議的是，兩株同時(shí)發(fā)生CT135移碼突變的CtD

4、型菌株在雌鼠生殖道感染模型中有顯著的毒力差異。
　　目前Ct CT135基因是否編碼蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)的定位、蛋白質(zhì)的功能、其它衣原體種的同源基因是否有類似表型等都還不清楚。本課題目的是分析國內(nèi)Cps流行株的CT135同源基因的多態(tài)性、體外穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)的表達(dá)和定位，并探索構(gòu)建Cps CT135同源基因的無義突變體，以加深理解CT135及其同源基因的致病機(jī)制。在Ct基因組上，CT134、CT135、CT136三個(gè)功能未知的基因可能組成

5、一個(gè)操縱子，這三個(gè)基因的Cps同源基因分別為B598_0589、B598_0590和B598_0557，它們的氨基酸同源性分別為26％，21％和65％。鑒于Ct的這三個(gè)基因可能組成操縱子，本課題分析了這三個(gè)同源基因的蛋白質(zhì)表達(dá)和定位。
　　本課題首先建立了基于CelⅠ酶的單核苷酸突變檢測(cè)技術(shù)，分析了庫存Cps菌株B598_0590基因的多態(tài)性和體外穩(wěn)定性。利用硫酸銨沉淀法從西芹汁中提取了CelⅠ酶，經(jīng)雜合雙鏈DNA酶切鑒定，提取的

6、CelⅠ酶具有良好的單核苷酸突變檢測(cè)活性。用CelⅠ酶對(duì)庫存九株Cps的B598_0590基因進(jìn)行了突變分析，發(fā)現(xiàn)庫存Cps菌株的B598_0590均不存在多態(tài)性，進(jìn)一步基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)所有菌株均編碼完整的B598_0590，測(cè)序圖譜上各堿基無明顯重疊峰（這與Cel結(jié)果相一致）?？紤]到國內(nèi)Cps菌株均為雞胚分離和傳代，而不是國外常用的細(xì)胞法，而Ct CT135基因多態(tài)性在雞胚模型中還缺乏研究。利用乙基乙烷磺酸酯(EMS)處理Cps CG

7、1株后，分成24組在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代20次，使CG1株適應(yīng)Vero，然后進(jìn)行基因測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)24組CG1的B598_0590均保持完整。顯然，以上發(fā)現(xiàn)與Ct中報(bào)道的CT135的體內(nèi)外不穩(wěn)定性不一致。
　　衣原體在特有的包涵體內(nèi)增殖，其蛋白質(zhì)可定位于菌體內(nèi)部及表面、包涵體腔及包涵體膜、和細(xì)胞質(zhì)。定位于包涵體膜和細(xì)胞質(zhì)的衣原體蛋白可與細(xì)胞質(zhì)直接接觸，被認(rèn)為與調(diào)控宿主信號(hào)通路相關(guān)。本課題利用原核表達(dá)載體pGEX-4T-1和pEA

8、SY-Blunt E1表達(dá)純化了Cps CG1株的B598_0589、B598_0590、B598_0557、包涵體膜蛋白IncA、主要外膜蛋白MOMP和分泌蛋白CPAF，免疫小鼠制備了抗血清。采用共聚焦免疫熒光法，在感染后30小時(shí)，發(fā)現(xiàn)B598_0590的染色特征與IncA相似之處是包涵體膜濃染，這表明B598_0590編碼包涵體膜蛋白;二者不同之處是多數(shù)包涵體內(nèi)部也有B598_0590著色，說明該蛋白可能也在菌體或包涵體腔內(nèi)分布。B

9、598_0589與B598_0557的染色特征與MOMP相似，說明它們可能為菌體膜蛋白。免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)了抗血清的特異性，且沒有發(fā)現(xiàn)三個(gè)功能未知蛋白存在翻譯后修飾。
　　Cps B598_0590編碼包涵體膜蛋白的發(fā)現(xiàn)在LpxC抑制劑和青霉素測(cè)試實(shí)驗(yàn)中得到了進(jìn)一步驗(yàn)證。青霉素不影響Ct包涵體的生長、染色體復(fù)制但可有限影響菌體分裂及網(wǎng)狀體至原體的轉(zhuǎn)化，此時(shí)網(wǎng)狀體體積顯著增大。LpxC抑制劑是一種新型抗生素，可抑制細(xì)菌類脂A的合

10、成。據(jù)報(bào)道，該抗生素不影響Ct的包涵體發(fā)育和正常生長分裂，但會(huì)顯著抑制網(wǎng)狀體至原體的轉(zhuǎn)化和菌體感染性。這兩種藥物對(duì)Cps生長發(fā)育的影響還缺乏研究，但如果導(dǎo)致菌體體積增大會(huì)有助于分析比較蛋白質(zhì)的定位。本研究發(fā)現(xiàn)LpxC抑制劑和青霉素均可顯著抑制CG1的菌體分裂和包涵體生長，共聚焦免疫熒光發(fā)現(xiàn)兩種抗生素對(duì)CG1蛋白質(zhì)的表達(dá)有不同的影響。例如，青霉素可完全抑制IncA的分泌，而LpxC抑制劑處理的CG1仍能將IncA分泌至包涵體膜，形成典型的

11、空泡結(jié)構(gòu)。重要的是，經(jīng)LpxC抑制劑處理的CG1經(jīng)B598_0590抗血清染色后也能形成類似IncA染色的空泡結(jié)構(gòu)，這進(jìn)一步證實(shí)了B598_0590編碼包涵體膜蛋白。
　　以上發(fā)現(xiàn)Cps B598_0590編碼包涵體膜蛋白也與生物信息學(xué)分析結(jié)果相一致。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，包涵體膜蛋白含有一段約60個(gè)氨基酸組成的兩個(gè)連續(xù)的疏水裂片(lobe)。經(jīng)比對(duì)預(yù)測(cè)，CT135同源基因在衣原體屬內(nèi)的12個(gè)種都存在，且有相似的疏水特征，它們都有相同大小的

12、兩個(gè)連續(xù)的疏水裂片。研究者利用此特征已在Ct中鑒定了多個(gè)包涵體膜蛋白，并預(yù)測(cè)Ct的CT134、CT135均編碼包涵體膜蛋白，但沒有對(duì)這兩個(gè)蛋白進(jìn)行鑒定。本研究發(fā)現(xiàn)，Cps B598_0589、B598_0590分別與CT134、CT135同源，但只有B598_0590是包涵體膜蛋白。為進(jìn)一步比較Cps與Ct包涵體膜蛋白的種類和同源性，研究中對(duì)Cps GR9株基因組中的所有假設(shè)蛋白和膜蛋白進(jìn)行了疏水性分析，與基因組中注釋的三個(gè)包涵體膜蛋白

13、一起，共發(fā)現(xiàn)了46個(gè)可能的包涵體膜蛋白。這些蛋白中，除了已明確IncA與包涵體融合有關(guān)，其它均為功能未知蛋白。而且，只有21個(gè)Cps包涵體膜蛋白在Ct中有同源蛋白，B598_0590即是其中之一，這21個(gè)蛋白在衣原體屬中全部存在同源蛋白，這說明這些少數(shù)同源的包涵體膜蛋白高度保守，可能有類似的功能、可能與對(duì)人的致病性相關(guān)，而多數(shù)沒有同源性的包涵體膜蛋白可能與衣原體的宿主特異性有關(guān)。
　　為進(jìn)一步研究B598_0590的功能，本研究探

14、索了TargeTron基因敲除技術(shù)在Cps中的應(yīng)用。首先設(shè)計(jì)了B598_0590基因的Ⅱ型內(nèi)含子插入位點(diǎn)和引物，構(gòu)建了基于pACD4K-C的敲除載體，并在E.coli中驗(yàn)證了敲除載體插入滅活質(zhì)粒載體攜帶的B598_0590基因的可行性。目前Ct的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化多使用β-內(nèi)酰胺酶作為篩選標(biāo)記，因此用MluⅠ切除了敲除載體的卡那霉素抗性基因，并重新引入了β-內(nèi)酰胺酶基因，在此基礎(chǔ)上將Ⅱ型內(nèi)含子的啟動(dòng)子在T7基礎(chǔ)上分別增加CpsB598_0249基

15、因或ompA基因的啟動(dòng)子，從而完成了基于兩個(gè)Cps內(nèi)源啟動(dòng)子的B598_0590敲除載體的構(gòu)建，這為下一步構(gòu)建Cps突變體奠定了基礎(chǔ)。
　　為制備衣原體屬特異性的LPS表位抗原和抗體，本研究利用TargeTron技術(shù)初步構(gòu)建了表達(dá)衣原體LPS表位的大腸桿菌突變體。衣原體的LPS實(shí)質(zhì)上是由數(shù)個(gè)Kdo組成的脂寡糖，衣原體屬內(nèi)各種的LPS均有保守且特殊的α-Kdo-(2→8)-α-Kdo結(jié)構(gòu)，該表位由多功能的Kdo轉(zhuǎn)移酶KdtA負(fù)責(zé)合成

16、。先用T載體將Ct L2的kdtA基因克隆入E.coli BL21(DE3)，然后利用TargeTron技術(shù)在E.coli的內(nèi)源kdtA基因內(nèi)插入Ⅱ型內(nèi)含子，獲得了突變體E.coli kdtA∷GⅡCtkdtA。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明該突變體可表達(dá)衣原體屬特異性的Kdo表位。將該E.coli突變體甲醛滅活后免疫小鼠，獲得的免疫血清可與Cps發(fā)生特異反應(yīng)，說明重組的Kdo表位具有良好的免疫原性，可用于制備衣原體屬特異性抗體。
　　綜上所述

17、，本研究建立了基于CelⅠ酶的單核苷酸突變檢測(cè)技術(shù)，可用于今后建立基于TILLING的Cps反向遺傳學(xué)技術(shù);利用CelⅠ酶和測(cè)序方法分析了國內(nèi)Cps流行株的基因多態(tài)性和體外細(xì)胞模型上的穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)Cps菌株的CT135同源基因均保持完整，在Vero細(xì)胞上CG1株的CT135同源基因可能與生長適應(yīng)性無明顯關(guān)聯(lián);采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)了Cps編碼的所有包涵體膜蛋白，并通過生物信息學(xué)方法、共聚焦免疫熒光、青霉素和LpxC抑制劑測(cè)試實(shí)驗(yàn)一致