鸚鵡熱嗜衣原體半胱氨酸脫硫酶CPSIT_0959的結(jié)構(gòu)和相關功能初步研究.pdf

1、[目的]預測鸚鵡熱嗜衣原體（Chlamydophila psittaci，Cps）半胱氨酸脫硫酶CPSIT_0959的模擬結(jié)構(gòu)，并進行其相關的功能性研究。
　　[方法]利用SWISS-MODEL同源建模的方法分析和模擬CPSIT_0959的結(jié)構(gòu)。提取Cps6BC菌株DNA作為模板，設計特異性引物，運用PCR技術(shù)從Cps6BC基因組中擴增 CPSIT_0959基因，并構(gòu)建pET-30 a-CPSIT_0959原核表達載體，然后轉(zhuǎn)化到

2、宿主菌E. coliBL21中，IPTG誘導His-CPSIT_0959重組蛋白表達，Western blotting分析和鑒定表達產(chǎn)物。進一步用Ni-NTA親和層析法純化重組蛋白，BCA法測定蛋白濃度。用該重組蛋白免疫 BALB/c雌性小鼠，間接ELISA法檢測免疫小鼠血清中重組蛋白多克隆抗體的效價，并以制備的多克隆抗體為一抗，采用間接免疫熒光法分析內(nèi)源性CPSIT_0959蛋白在HeLa細胞中的定位情況。根據(jù)半胱氨酸脫硫酶的脫硫反應

3、機制，檢測硫化物的產(chǎn)生來證實其具有脫硫酶的活性。
　　[結(jié)果]分析模擬出了CPSIT_0959蛋白的三維結(jié)構(gòu)；成功構(gòu)建了pET-30a-CPSIT_0959原核表達載體，其測序結(jié)果與Genbank上登錄序列完全一致，并表達和純化較穩(wěn)定的重組蛋白；將純化好的CPSIT_0959重組蛋白免疫BALB/c雌性小鼠，低速離心收集血清，利用間接ELISA法檢測其抗體效價高達1:512000。在 Cps感染 HeLa細胞48h后采用間接免疫熒

4、光法觀察到CPSIT_0959的分布特征與主要外膜蛋白MOMP相似，而與包涵體膜蛋白IncA的分布模式完全不同。根據(jù)半胱氨酸脫硫酶的脫硫反應機制，檢測并證實原核表達并純化的CPSIT_0959蛋白具有半胱氨酸脫硫酶的活性，能催化L-半胱氨酸分解產(chǎn)生硫化物，可能參與了衣原體內(nèi)鐵硫簇的生物合成。
　　[結(jié)論]1.成功克隆表達了His-CPSIT_0959，該蛋白可能定位在 Cps包涵體內(nèi)；2.CPSIT_0959具有半胱氨酸脫硫酶的活