鸚鵡熱嗜衣原體CPAF重組蛋白在診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、目的:從鸚鵡熱嗜衣原體(Chlamydophila psittaci,C.psittaci,Cps)中篩選出CpsCPAF序列,分析挑選其免疫優(yōu)勢(shì)表位,進(jìn)行體外克隆表達(dá)與純化。用該重組蛋白建立血清學(xué)診斷方法,評(píng)價(jià)其在Cps感染血清學(xué)早期診斷中的應(yīng)用。期望篩選出能應(yīng)用于Cps抗體檢測(cè)的抗原,豐富Cps感染血清學(xué)診斷的候選抗原庫(kù),為建立Cps感染的快速診斷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),選擇Cps6BC株的CPAF蛋白免

2、疫優(yōu)勢(shì)區(qū)基因,進(jìn)行構(gòu)建 pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒,并用 IPTG誘導(dǎo)其蛋白表達(dá),結(jié)果用SDS-PAGE蛋白電泳和Western blot鑒定;重組蛋白以GST瓊脂糖凝膠FF進(jìn)行純化,以純化的重組蛋白作為包被抗原,建立其血清學(xué)診斷的間接ELISA法;重組蛋白的免疫反應(yīng)性以Western blot和間接ELISA方法分析;用純化的重組蛋白免疫新西蘭兔,以鑒定重組蛋白的免疫原性。并同時(shí)用已有的ELISA試劑盒與建立的間接ELISA

3、方法檢測(cè)Cps感染血清標(biāo)本,比較他們的敏感性與特異性,以便該重組蛋白在Cps感染診斷中的應(yīng)用價(jià)值進(jìn)行評(píng)估。
　　結(jié)果:在線分析 CPAF基因,篩選出目的基因片段(586~1351bp位堿基,共765bp),并擴(kuò)增出CPAF基因目的片段;經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定證明構(gòu)建的重組質(zhì)粒插入序列正確。經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳與Western blot分析,證實(shí)重組菌所表達(dá)的蛋白為CPAF蛋白,大小約為54 kDa,且目的蛋白為包涵體。包涵體經(jīng)復(fù)性

4、純化后,純度在95﹪以上。經(jīng)Western blot分析鑒定,能特異性的結(jié)合CpsCPAF陽(yáng)性血清,具有良好的反應(yīng)原性。將純化的CPAF重組蛋白免疫新西蘭兔,證實(shí)該重組蛋白具有良好的免疫原性,且兔免疫血清特異性抗體效價(jià)大于1:8000。自建的間接ELISA法以純化的CPAF重組蛋白為診斷抗原,與Cps參考血清反應(yīng),符合率均為100﹪。與肺炎嗜衣原體(C. pneumoniae,Cpn),沙眼衣原體(C. trachomatis,Ct)無(wú)

5、交叉反應(yīng)。對(duì)180份病鴨血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),與商品 Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA試劑盒比較。自建的ELISA法符合率均為100﹪, Birds Chlamydia Psittaci IgG ELISA Kit符合率為77.5~95﹪。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建pGEX6p-2/CPAFm重組質(zhì)粒,在E.coli BL21中誘導(dǎo)表達(dá)出分子量為54kDa的CPAFm重組蛋白;