弓形蟲P30重組蛋白的表達、純化及診斷應用研究.pdf

1、目的:構建含剛地弓形蟲(Toxoplasma gondii)表膜蛋白P30基因的表達載體,在大腸桿菌中誘導表達,純化表達產物P30并進行抗原性分析,研究P30在弓形蟲病血清學診斷中的應用價值。
　　方法:(1)P30蛋白的表達、純化與復性巨噬細胞培養(yǎng)弓形蟲,提取弓形蟲DNA為模板,PCR擴增目的片斷,將目的片斷克隆至pUCm-T Vector,酶切和PCR鑒定,再亞克隆到原核表達載體pET28b(+)中、構建重組質粒pET28b(

2、+)/P30,經酶切、PCR及測序鑒定后轉化至表達宿主菌BL21(DE3)中誘導表達,SDS-PAGE和Western-Blot鑒定表達產物;包涵體經8M尿素變性,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白,變性蛋白經稀釋透析復性,SDS-PAGE和Western-Blot分析和鑒定復性P30蛋白,BCA法測定復性蛋白濃度,用于ELISA包板。(2)小鼠弓形蟲抗血清的制備及臨床弓形蟲病患者陽性血清的收集弓形蟲速殖子經-80℃反復冷凍3次,經減毒

3、后感染昆明小鼠,制備小鼠弓形蟲陽性血清,收集臨床弓形蟲病人血清。(3)弓形蟲病人IgG抗體ELISA檢測方法的建立以純化復性后的P30包板,間接 ELISA檢測臨床弓形蟲病人血清中抗弓形蟲的抗體,以小鼠弓形蟲陽性血清為對照,同時與國外進口試劑盒的檢測結果比較,評價純化的P30在弓形蟲病血清學診斷中的應用價值。
　　結果:PCR擴增得到長800bp的目的片斷,測序結果與Genbank上登錄序列一致;含pET28b(+)/P30重組菌

4、經IPTG誘導,SDS-PAGE電泳結果顯示,得到一分子量(Mr)約30 kDa的重組蛋白,目的蛋白在菌體細胞內以包涵體形式存在;8M尿素溶解后經Ni-NTA親和柱純化獲得了純度大于95％的重組蛋白;復性后,得到溶解狀態(tài)的復性蛋白,Western-Blot結果顯示,該蛋白能被抗6-His單抗、小鼠抗弓形蟲血清和部分臨床弓形蟲病患者陽性血清識別;以純化的P30重組蛋白為包被抗原建立間接 ELISA法,檢測小鼠抗弓形蟲血清和臨床弓形蟲病患者