X-射線輻射對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生物學(xué)特性的影響及蛋白組學(xué)研究.pdf

1、乳腺癌是危害女性健康常見惡性腫瘤之一。放射治療是乳腺癌治療的重要手段之一，然而由于個(gè)體或腫瘤細(xì)胞對(duì)射線的輻射敏感性存在差異，導(dǎo)致放療療效的差異。在放療中，利用各種輔助手段降低腫瘤細(xì)胞的輻射抗性，增加其輻射敏感性，是提高腫瘤放療療效的重要途徑。因此，研究 X-射線對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，對(duì)于提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性并了解其相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制具有重要的理論意義。
　　1. X-射線輻射對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-

2、231生物學(xué)特性的影響
　　目的：比較不同劑量的X-射線輻射對(duì)乳腺癌MDA-M B-231細(xì)胞的增殖、周期和凋亡的影響，分析其生物學(xué)特性與細(xì)胞輻射敏感性關(guān)系。
　　方法：選擇指數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌MDA-M B-231細(xì)胞，不同劑量(0、1、2、4、8、10 Gy)的X-射線輻射后24 h，48 h和72 h采用MTT法檢測(cè)MDA-MB-231的增殖能力，比較不同劑量的X-射線輻射對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用；輻照后

3、24 h和48 h，采用PI單染法和Annexin V/PI雙染法分別檢測(cè)細(xì)胞周期分布與凋亡，通過流式細(xì)胞儀計(jì)算并分析不同劑量的X-射線輻射對(duì)MDA-M B-231細(xì)胞周期與凋亡的影響。
　　結(jié)果：MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，X-射線輻射后，在24 h、48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)上，各劑量點(diǎn)的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力減弱，其抑制率隨劑量和時(shí)間的變化而變化。在48 h和72 h時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞的抑制率隨劑量的增加而增加；但72 h各劑量點(diǎn)

4、的抑制率顯著低于48 h各劑量點(diǎn)的抑制率，24 h時(shí)間點(diǎn)上各劑量點(diǎn)和對(duì)照組相比均表現(xiàn)出一定的抑制作用；在各劑量點(diǎn)，細(xì)胞的抑制率都隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。凋亡結(jié)果顯示，不同劑量的X-射線輻射MDA-M B-231細(xì)胞后，在24 h和48 h時(shí)間點(diǎn)，細(xì)胞總凋亡率隨著劑量的升高而增加，且同一劑量點(diǎn)在照射后24 h的總凋亡率大于48 h的總凋亡率。24 h和48 h各劑量點(diǎn)的早期凋亡率無明顯差異，24 h不存在劑量依賴性，但48 h

5、存在劑量依賴性，即隨劑量的增加細(xì)胞凋亡逐漸增多；24 h和48 h各劑量點(diǎn)的晚期凋亡率存在明顯差異，24 h和48 h均存在劑量依賴性，且同一劑量24 h的晚期凋亡率高于48 h的晚期凋亡率。細(xì)胞周期結(jié)果顯示。X-射線輻射后24 h和48 h，乳腺癌MDA-M B-231細(xì)胞的周期影響主要表現(xiàn)為G2/M期周期阻滯，24 h和48 h均表現(xiàn)出細(xì)胞百分比隨劑量的增加呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，低劑量（1，2 Gy）時(shí)，G2/M期阻滯沒有顯著性差異（P>0

6、.05），高劑量（4，8，10 Gy）照射時(shí)，G2/M期阻滯存在顯著性差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：X-射線輻射能有效的抑制乳腺癌MDA-M B-231細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
　　2. X-射線輻射后乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231差異蛋白表達(dá)質(zhì)譜分析
　　目的：分析 X-射線輻射對(duì) MDA-M B-231細(xì)胞蛋白表達(dá)譜的影響，通過比較蛋白表達(dá)圖譜，篩選、鑒定差異表達(dá)蛋白質(zhì)，進(jìn)而得到

7、 X-射線輻射對(duì)MDA-M B-231細(xì)胞作用的相關(guān)的分子標(biāo)志物，為以后明確腫瘤放射敏感性的相關(guān)機(jī)制和相應(yīng)輻射增敏產(chǎn)品的開發(fā)提供幫助。
　　方法：選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞，4 Gy X-射線輻射（實(shí)驗(yàn)組）和不經(jīng)X-射線輻射（對(duì)照組）后48h，對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞總蛋白進(jìn)行雙向電泳，2D凝膠通過Versadoc4000 images system捕獲圖像。分別在凝膠上選取幾個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)進(jìn)行挖點(diǎn)、酶解、萃取、上

8、樣，隨后使用API4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀MALDI-TOF/TOF(Applied Biosystems)進(jìn)行分析。
　　結(jié)果：通過分析比較，本實(shí)驗(yàn)一共篩選出32個(gè)蛋白差異點(diǎn)。與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中共有17個(gè)蛋白點(diǎn)表現(xiàn)為上調(diào)，15個(gè)蛋白點(diǎn)表現(xiàn)為下調(diào)。分別在凝膠上選取32個(gè)差異明顯的蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，蛋白質(zhì)譜結(jié)果顯示8個(gè)差異蛋白的具體信息，它們分別是：HSC70，GRP78，IMPDH2，EIF4H，GAPDH，VIM和微

9、管相關(guān)蛋白（TUBA1B，TUBA8）。其中HSC70，GRP78，IMPDH2蛋白表達(dá)上調(diào)，EIF4H，GAPDH，VIM和微管相關(guān)蛋白（TUBA1B，TUBA8）表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：X-射線輻射影響MDA-M B-231細(xì)胞蛋白表達(dá)譜。差異表達(dá)蛋白質(zhì)譜鑒定結(jié)果顯示，X-射線輻射誘導(dǎo) MDA-MB-231細(xì)胞熱休克蛋白70家族成員HSC70，次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（IMPDH2），葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78），真核翻譯起始因