Celecoxib通過NF-κB通路調(diào)控人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生物活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乳腺癌是女性常見的一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤。資料表明,目前我國(guó)乳腺癌發(fā)病率正以每年2％-3％的速度遞增,10年間我國(guó)主要城市的乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)了37％。特別是在30-54歲年齡組中,乳腺癌已成為威脅女性健康的“頭號(hào)殺手”。受體三陰性乳腺癌(triple-negative breast cance,TNBC)是近些年學(xué)者提出的一個(gè)新的乳腺癌亞型,是指腫瘤細(xì)胞膜表面缺乏雌激素受體(estrogen receptor,ER)、孕激素受體(pr

2、ogesteronereceptor,PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體-2(human epidermal growth factorreceptor-2,HER-2)的一類乳腺癌。TNBC的發(fā)病率占乳腺癌總發(fā)病率的11％-20％,尤其好發(fā)于年輕女性,且該類乳腺癌具有術(shù)后易復(fù)發(fā)、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和預(yù)后差的特點(diǎn),對(duì)內(nèi)分泌治療和針對(duì)HER-2的靶向治療無效,至今仍缺乏令人滿意的綜合治療方案。
　　 近年來,非甾體類抗炎約物(nonsteroid

3、ai anti-inflammatory drugs,NSAIDs)在抑制腫瘤活性方面展示了很好的應(yīng)用前景,大最體內(nèi)外研究顯示,常規(guī)服用NSAIDs可以大幅度降低乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),因此,該類藥物引起了廣大學(xué)者的關(guān)注。Harris等研究發(fā)現(xiàn),新一代特異性環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑celecoxib,不僅能明顯延遲腫瘤的發(fā)生,還可以降低乳腺癌的發(fā)病率及腫瘤體積。目前,有學(xué)者研究認(rèn)為,cele

4、coxib的抗腫瘤作用機(jī)制可能與降低腫瘤組織COX-2表達(dá)、抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。但也有學(xué)者認(rèn)為celecoxib的抗腫瘤作用機(jī)制并不是依賴抑制COX-2途徑,其具體作用機(jī)制目前尚存在爭(zhēng)議。
　　 Kim和Subhashini等研究報(bào)道,celecoxib可通過NF-λB(nuclear factorkappa B,NF-κB)途徑抑制宮頸癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而NF-κB活性失控與腫瘤的

5、形成密切相關(guān),且TNBC中NF-κB異?；罨?因此我們想闡明在TNBC中celecoxib是否主要通過下調(diào)異?；罨腘F-κB而發(fā)揮作用。
　　 NF-κB是1986年發(fā)現(xiàn)的,從成熟的B淋巴細(xì)胞中抽提出的能與免疫球蛋白κ鏈基因增強(qiáng)子結(jié)合的核因子。抑制NF-κB活性可以抑制腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療約物的敏感性、抑制炎癥反應(yīng)、減少腫瘤血管生成等。作為NF-κB主要發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的亞基p65,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展

6、中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用,下調(diào)p65的表達(dá)可以抑制多種腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)外的增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此,p65的靶向治療可能在乳腺癌的臨床治療中擁有廣泛的應(yīng)用前景。
　　 目的:本實(shí)驗(yàn)中選取三陰性高侵襲性的人乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231作為研究對(duì)象,通過不同的實(shí)驗(yàn)方法探討celecoxib的抑癌作用,研究celecoxib在三陰性乳腺癌細(xì)胞中對(duì)NF-κB活性的影響;檢測(cè)異常活化的NF-κB信號(hào)通路在MDA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡以及

7、侵襲中發(fā)揮的作用;評(píng)價(jià)celecoxib是否能夠成為TNBC個(gè)體化治療的輔助用藥,針對(duì)NF-κB信號(hào)通路的靶向治療能否使乳腺癌的化學(xué)治療更加完善,最終為預(yù)防、治療TNBC提供新的治療思路。
　　 方法:
　　 1以不同濃度的celecoxib作用人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231,MTT比色法觀察其對(duì)該細(xì)胞增殖的影響,并進(jìn)一步探討celecoxib抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖與COX-2途徑依賴關(guān)系。采用流式細(xì)

8、胞儀技術(shù)(flow cytometry,FCM)、Hoechst33258、DNA Ladder形成實(shí)驗(yàn)、western blot等方法,研究celecoxib對(duì)體外培養(yǎng)的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡的影響。
　　 2采用傷口愈合實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)等,觀察ceiecoxib對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞侵襲行為的影響。并通過RT-PCR法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵的細(xì)胞因子,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular en

9、dothelialgrowth factor,VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)及IL-8(interleukin-8,IL-8)的表達(dá)變化,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)IL-8的分泌水平。
　　 3為了研究celecoxib的抗凋亡、抑制細(xì)胞侵襲作用與NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系,應(yīng)用west

10、ern blot方法檢測(cè)了不同濃度celecoxib作用后MDA-MB-231細(xì)胞的p65、p50、IκBα(inhibitory kappaBα,IκBα)以及磷酸化IκBα(p-IκBα)蛋白的表達(dá)情況,并進(jìn)一步通過western blot法檢測(cè)p65的核轉(zhuǎn)位變化。采用凝膠電泳遷移率改變分析(clectrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測(cè)用藥前后NF-κB DNA結(jié)合活性的改變。
　　

11、 4構(gòu)建表達(dá)p65cDNA的真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細(xì)胞,觀察過表達(dá)p65基因?qū)DA-MB-231細(xì)胞增殖、凋亡及侵襲的影響,并通過與celecoxib聯(lián)合作用,揭示celecoxib和NF-κB信號(hào)通路之間的聯(lián)系。
　　 5利用微小RNA(microRNA,miRNA)技術(shù),構(gòu)建表達(dá)p65miRNA的真核表達(dá)載體,沉默p65基因的表達(dá),觀察NF-κB信號(hào)通路阻斷對(duì)人乳癌細(xì)胞MDA-MB-231增殖、凋亡以及侵

12、襲的影響。
　　 結(jié)論:
　　 1.Celecoxib能夠有效地抑制人三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖,其抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性,該作用與COX-2途徑無關(guān)。Celecoxib可以誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡,作用途徑可能與活化caspase-3、PARP分子有關(guān)。Celecoxib能夠有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的水平運(yùn)動(dòng)及侵襲行為,其抑制作用呈劑量-效應(yīng)依賴性。Celecoxib可以降低MDA

13、-MB-231細(xì)胞的VEGF、MMP-2、IL-8 mRNA表達(dá)以及IL-8的分泌水平。NF-κB信號(hào)通路可能是MDA-MB-231細(xì)胞增殖的主要調(diào)控通路。Celecoxib可能是通過抑制p65蛋白的合成及其核轉(zhuǎn)位、減少IκB的磷酸化降解,進(jìn)而抑制NF-κB活性,達(dá)到抑癌作用。
　　 2.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染外源p65基因,可以顯著增加MDA-MB-231細(xì)胞p65表達(dá)水平,過表達(dá)p65基因可以增加MDA-MB-231細(xì)胞NF-κB DNA

14、的結(jié)合活性,促進(jìn)細(xì)胞增殖,逆轉(zhuǎn)celecoxib對(duì)細(xì)胞活性的抑制作用,可以抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞的體外侵襲能力,并伴隨著VEGF、MMP-2和IL-8 mRNA的表達(dá)上調(diào)和IL-8分泌增加。
　　 3.轉(zhuǎn)染p65miRNA后,MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖能力受到顯著抑制,并可以增加凋亡細(xì)胞的比例,主要是通過下調(diào)survivin和XIAP的表達(dá)、裂解活化caspase-3和PARP蛋白而實(shí)現(xiàn)的。抑制p65表達(dá)可以顯著降低MD