乳腺癌MDa-MB-231細(xì)胞中CD105+-CD90+細(xì)胞群的特性研究.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞的起源通常認(rèn)為是來源于一個(gè)正常的干細(xì)胞，他們擁有類似的生物學(xué)特性，是腫瘤抗藥性、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的潛在原因。CD105、CD90是國際細(xì)胞療法協(xié)會(huì)(International Society for Cellular Therapy, ISCT)對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，越來越多的研究已經(jīng)證實(shí)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有趨向原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤部位的特性。CD105是判斷乳腺

2、癌預(yù)后的一個(gè)獨(dú)立的因素，若腫瘤細(xì)胞高表達(dá)CD105，那么病人的無病生存率和總生存率均較低，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌中，CD105可能會(huì)是一個(gè)生物治療的有效靶點(diǎn)。Yang等在2008年的Cancer Cell雜志中研究顯示CD90有可能對(duì)于肝癌干細(xì)胞候選標(biāo)志物具有重要意義。近些年的研究熱點(diǎn)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition，EMT)可能在腫瘤的發(fā)生中一直發(fā)揮作用，EMT的誘導(dǎo)因子TWIST1和SNA

3、IL1經(jīng)常在乳腺原位導(dǎo)管癌(ductal carcinoma in situ，DCIS)中被檢測到，而表達(dá)TWIST1的管腔型乳腺上皮細(xì)胞可以促使乳腺癌的發(fā)生。近年研究發(fā)現(xiàn)EMT誘導(dǎo)過程賦予了細(xì)胞類干細(xì)胞樣的特性，加之CD105聯(lián)合CD90可作為間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)記物已被廣泛接受，因此我們考慮了這兩種標(biāo)記物與EMT進(jìn)而與乳腺癌的轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　 目的:本研究選取人乳腺癌高骨轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系MDA-MB-231，利用CD105和C

4、D90兩個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物運(yùn)用流式細(xì)胞儀分選從親代細(xì)胞中嘗試富集一群“類間充質(zhì)”表型的細(xì)胞，通過觀察各細(xì)胞亞群的增殖能力，進(jìn)行Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)，以及對(duì)干細(xì)胞相關(guān)基因檢測，研究它們是否具有干細(xì)胞特性，探尋乳腺癌干細(xì)胞與EMT的相關(guān)性，為乳腺癌復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移的機(jī)理研究并為腫瘤干細(xì)胞理論奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:干細(xì)胞具有慢周期性、未分化性、自我更新和體外增殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)。本研究選取人乳腺癌高骨轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系MDA-MB-231進(jìn)行研

5、究。
　　 1.將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，經(jīng)CD105-RPE、CD90-FITC抗體標(biāo)記后，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測其分別在MDA-MB-231細(xì)胞中的表達(dá)概率，并分選得到CD105+/CD90+、CD105-/CD90-兩組細(xì)胞亞群。
　　 2.分選后分別培養(yǎng)CD105+/CD90+雙陽性亞群、CD105-/CD90-雙陰性亞群和MDA-MB-231親代細(xì)胞（親代細(xì)胞群）三個(gè)不同群體細(xì)胞，當(dāng)其處于對(duì)

6、數(shù)生長期時(shí)，在96孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)初始濃度相同的各組細(xì)胞，比較觀察CD105+/CD90+、CD105-/CD90-組和MDA-MB-231細(xì)胞混合群體三組細(xì)胞群的增殖能力。應(yīng)用SRB法，檢測在細(xì)胞貼壁后9天內(nèi)的不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)量，做出生長曲線。
　　 3.細(xì)胞遷徙實(shí)驗(yàn)將處于對(duì)數(shù)生長期的三組細(xì)胞群，應(yīng)用Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)比較各細(xì)胞群的遷徙能力。
　　 4.細(xì)胞周期檢測干細(xì)胞具有慢周期性，包含更多的靜止期細(xì)胞。運(yùn)用

7、流式細(xì)胞儀檢測三組細(xì)胞群的細(xì)胞周期，比較G0/G1期、S期及G2/M期在各細(xì)胞群中是否具有差異。
　　 5.各細(xì)胞群的干細(xì)胞特性基因檢測應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)和Quantitative real-time PCR方法檢測oct3/4(octamer-binding transcription factor-4), nanog, sox2(SRY-related high-mobility-group-boxp

8、rotein-2)，klf4(kruppel-like factor-4)4種胚胎干細(xì)胞特有基因的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)用7500 version2.0.6軟件分析。
　　 6.所有數(shù)據(jù)結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料多組間比較采用單因素的方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，每兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用(x)±s表示。計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)（x2檢驗(yàn)），檢驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)

9、意義(P*＜0.05，P**＜0.01）。
　　 結(jié)果:
　　 1.將處于對(duì)數(shù)生長期的乳腺癌，經(jīng)CD105-RPE、CD90-FITC抗體標(biāo)記后。使用流式細(xì)胞儀檢測出MDA-MB-231細(xì)胞總?cè)后w中CD105陽性率為4.93％，CD90陽性率為3.31％，表達(dá)CD105+/CD90+雙陽性概率為0.99％，表達(dá)CD105-/CD90-雙陰性概率為90.77％。
　　 2.雙陽性亞群、雙陰亞群組、親代細(xì)胞群的生長曲

10、線顯示:9天內(nèi)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)雙陽性細(xì)胞增殖速度明顯較親代細(xì)胞群和雙陰性亞群快。
　　 3.Transwell遷徙實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:三組細(xì)胞分別培養(yǎng)于Transwell上室后，培養(yǎng)后12小時(shí)觀察穿過聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù)（用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示）:雙陽性亞群為3.4000±0.96609;親代細(xì)胞群為1.9000±1.19722;雙陰性亞群為1.2000±0.91894。統(tǒng)計(jì)分析表明雙陽性亞群較親代細(xì)胞群和雙陰性亞群的穿膜細(xì)胞多，(P＜0.05)

11、;親代細(xì)胞群和雙陰性亞群比較穿過膜的細(xì)胞數(shù)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 24小時(shí)觀察穿過聚碳酯膜的細(xì)胞數(shù):雙陽性亞群為7.7000±1.63639，親代細(xì)胞群為4.3000±0.82327，雙陰性亞群為2.9000±0.91894。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明:雙陽性亞群細(xì)胞較親代細(xì)胞群和雙陰性亞群的穿膜細(xì)胞多(P＜0.05)，親代細(xì)胞群比雙陰性亞群的穿膜細(xì)胞多(P＜0.05)。
　　 將三種細(xì)胞分別于Transwell

12、上室培養(yǎng)72小時(shí)，觀察細(xì)胞穿過聚碳酯膜進(jìn)入下室后貼壁生長情況。計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞:雙陽性亞群為44.0000±3.60555，親代細(xì)胞群為10.0000±2.64575，雙陰性亞群為7.3333±1.52753。方差分析顯示:雙陽性亞群較親代細(xì)胞群和雙陰性亞群的穿膜后貼壁細(xì)胞多(P＜0.01)，親代細(xì)胞群與雙陰性亞群細(xì)胞進(jìn)入下室的貼壁細(xì)胞數(shù)比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　 4.三組細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測:雙陽性亞群細(xì)胞的G0/G1

13、期占50.7％±1.58％，S期占27.3％±2.54％，G2/M期占22％±1.76％，雙陰性亞群細(xì)胞G0/G1期占43.6％±1.62％， S期占42.2％±2.21％，G2/M期占14.1％±1.37％，親代細(xì)胞群細(xì)胞G0/G1期占48.2％±2.14％，S期占38.2％±2.81％，G2/M期占13.6％±1.43％。比較G0/G1期在各組細(xì)胞周期中的構(gòu)成比，雙陽性亞群與雙陰性亞群比較:x2=110.990; P＜0.01;雙陽

14、性亞群與親代細(xì)胞群比較:x2=38.591;P＜0.01;親代細(xì)胞群與雙陰性亞群比較:x2=4.385; P＜0.01;結(jié)果分析:雙陽性亞群有更多的細(xì)胞處于G0/G1期，干細(xì)胞具有慢周期性，包含更多的靜止期細(xì)胞。我們推論CD105+/CD90+雙陽性亞群可能具有類干細(xì)胞特性。
　　 5.RT-PCR結(jié)果:
　　 統(tǒng)計(jì)分析三組細(xì)胞群體的各干細(xì)胞特性基因表達(dá)結(jié)果如下:oct3/4檢測結(jié)果:雙陽性亞群為0.300839±0.0

15、003259，雙陰性亞群為0.104273±0.0004666，親代細(xì)胞群為0.167838±0.0001645。方差分析比較三個(gè)細(xì)胞群間F=257988.7，P＜0.01，兩兩比較LSD法分析顯示雙陽性亞群oct3/4基因表達(dá)最高，親代細(xì)胞群的次之，雙陰性亞群表達(dá)最低。nanog檢測結(jié)果:雙陽性亞群為0.741022±0.0004544，雙陰性亞群為0.279969±0.0008109，親代細(xì)胞群為0.571277±0.0004220

16、。方差分析比較三個(gè)細(xì)胞群間F=469563.0，P＜0.01，兩兩比較LSD法分析顯示雙陽性亞群nanog基因表達(dá)最高，親代細(xì)胞群的表達(dá)次之，雙陰性亞群表達(dá)最低。sox2檢測結(jié)果:雙陽性亞群為0.574776±0.0002915;雙陰性亞群為0.478683±0.000200538，親代細(xì)胞群為0.553225±0.0002452;方差分析比較三個(gè)細(xì)胞群F=123480.3，P＜0.01，兩兩比較LSD法分析表明雙陽性亞群的sox2基因

17、表達(dá)最高，親代細(xì)胞群表達(dá)次之，雙陰性亞群表達(dá)最低。klf4檢測結(jié)果:雙陽性亞群為0.603706±0.0003567;雙陰性亞群為0.093214±0.0001857，親代細(xì)胞群為0.371799±0.0001921，方差分析比較三個(gè)細(xì)胞群F=2959712.0，P＜0.01，兩兩比較LSD法分析表明雙陽性亞群的klf4基因表達(dá)最高，親代細(xì)胞群表達(dá)次之，雙陰性亞群表達(dá)最低。
　　 6.Quantitative real-time

18、 PCR結(jié)果:oct3/4基因在雙陽性亞群細(xì)胞中檢測到熒光時(shí)的循環(huán)平均數(shù)CTmean值為27.327±0.05，親代細(xì)胞群為26.004±0.11，雙陰性亞群為23.617±0.09。雙陽性亞群細(xì)胞oct3/4基因的表達(dá)水平分別是親代細(xì)胞群、雙陰性細(xì)胞群的2.448、2.517倍(P＜0.05）;
　　 nanog基因在雙陽性亞群細(xì)胞中檢測到熒光時(shí)循環(huán)的平均數(shù)CTmean值為29.805±0.04，親代細(xì)胞群為25.698±0.

19、11，雙陰性亞群為27.923±0.10。雙陽性亞群細(xì)胞nanog基因的表達(dá)水平分別是親代細(xì)胞群、雙陰性亞群的1.657、1.909倍(P＜0.05）;
　　 sox2基因在雙陽性亞群細(xì)胞中檢測到熒光時(shí)循環(huán)的平均數(shù)CTmean值為27.159±0.04，親代細(xì)胞群為25.104±0.12，雙陰性亞群為22.686±0.13。雙陽性亞群細(xì)胞sox-2基因的表達(dá)水平分別是親代細(xì)胞群、雙陰性亞群的1.460、1.481倍(P＜0.05

20、);
　　 klf4基因在雙陽性亞群細(xì)胞中檢測到熒光時(shí)循環(huán)的平均數(shù)CTmean值為27.977±0.03，親代細(xì)胞群體為25.983±0.12，雙陰性亞群為26.236±0.15。通過計(jì)算power值，雙陽性亞群細(xì)胞klf4基因的表達(dá)水平分別是親代細(xì)胞群、雙陰性亞群的1.817、8.494倍(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1、CD105和CD90與乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中干細(xì)胞相關(guān)。