初次RSV感染時(shí)間影響成年期再次感染時(shí)γδT細(xì)胞介導(dǎo)的氣道炎癥.pdf

1、目的：
　　嬰幼兒期嚴(yán)重RSV感染與兒童及成年期哮喘密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期小鼠相比，初次感染發(fā)生在新生期的小鼠成年期再次感染引起更為嚴(yán)重的全身癥狀和氣道炎癥，提示初次RSV感染時(shí)間決定再次感染時(shí)的疾病嚴(yán)重程度，但新生期初次RSV感染通過(guò)何種機(jī)制影響成年期再次感染時(shí)氣道炎癥反應(yīng)目前尚不十分清楚。
　　呼吸道黏膜系統(tǒng)的γδT細(xì)胞位于免疫防御第一道防線，在呼吸道黏膜局部抗感染免疫及免疫調(diào)節(jié)方面起作用。在抗

2、感染免疫的初次應(yīng)答中，γδT細(xì)胞可因抗原性質(zhì)的不同而分泌不同類型的細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)控免疫應(yīng)答的類型。我們前期研究工作亦發(fā)現(xiàn)，致敏前RSV感染明顯降低致敏鼠肺組織γδT細(xì)胞數(shù)量，并伴隨Th2型細(xì)胞因子及血清特異性IgE，IgG1水平的下降，推測(cè)γδT細(xì)胞及其所分泌的細(xì)胞因子在RSV感染所致肺組織炎性病變及喘息發(fā)作方面起重要作用。然而，γδT細(xì)胞在初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染所誘發(fā)的氣道炎癥反應(yīng)中具有怎樣的生物學(xué)作用及其作用機(jī)

3、制如何，目前尚不清楚。本研究利用初次RSV感染發(fā)生在不同年齡段，再次感染發(fā)生在成年期的模型鼠，探討在初次RSV感染時(shí)間對(duì)再次感染后氣道炎癥發(fā)生發(fā)展影響過(guò)程中，γδT細(xì)胞的作用以及免疫應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，為揭示新生期初次RSV感染與兒童期哮喘的相關(guān)性以及進(jìn)一步理解γδT細(xì)胞在哮喘發(fā)生發(fā)展中的作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　一、實(shí)驗(yàn)材料
　　1、主要試劑
　　PBS、Diff-Quick染液、HE染液、PAS染液、膠原

4、酶D(Sigma)、Dnsae I(Sigma)、水合氯醛、胎牛血清(TBD)、胰酶、青霉素、鏈霉素、紅細(xì)胞裂解液、小鼠淋巴細(xì)胞分離液(TBD)、4％多聚甲醛、ELISA試劑盒(R&D)、real-timeRT-PCR試劑盒（Takara）、總RNA提取試劑盒(Takara)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）、磁珠抗體(Miltenyi)、流式抗體FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3 mAb、PE/Cy7 an

5、ti-CD69 mAb及PE anti-IFN-γ/IL-4/IL-5/IL-13 mAb(BioLegend)。
　　2、病毒
　　用Hep-2細(xì)胞增殖人類呼吸道合胞病毒A2型(RSV A2)，采用30％蔗糖超速離心法分離病毒粒子，少量分裝，-80℃冰箱保存。RSV病毒滴度用組織細(xì)胞半數(shù)感染量(50％ Tissue culture infections dose，TCID50)表示。
　　二、試驗(yàn)方法
　　1、

6、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型
　　將購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司的6-8周BALB/c鼠在本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心繁殖飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)共設(shè)4組，組①:正常對(duì)照組（表示為:Mock）。對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予相同劑量PBS;組②:成年期一次RSV感染組（表示為:Adult1°）。于出生后第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠;組③:成年期初次RSV感染，成年期再次感染組（表示為:Adult2°）。于出生后第4周用20μl含2×106

7、 TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106TCID50的RSV病毒懸液經(jīng)鼻再次感染小鼠;組④:新生期初次RSV感染，成年期再次感染組（表示為:Neonatal2°）。于出生后第1周用10μl含2×105 TCID50的RSV的病毒懸液經(jīng)鼻感染小鼠，第8周用20μl含2×106 TCID50的RSV的病毒懸液經(jīng)鼻再次感染小鼠。去除γδ T細(xì)胞實(shí)驗(yàn):新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次RSV感染前1天及感染后第

8、2、3天，分別經(jīng)鼻粘膜給予10μg anti-TCRδ mAb[10，18]。
　　2、小鼠肺組織單細(xì)胞懸液制備
　　腹腔注射7.2％水合氯醛深度麻醉小鼠，經(jīng)心臟灌流20ml無(wú)菌PBS以去除血管內(nèi)血細(xì)胞后取肺組織。用10ml含有collagenase D(200μl10mg/ml)和DNaseⅠ(40μl10mg/ml)的10％ FBS RPMI-1640消化處理肺組織，淋巴細(xì)胞分離液分離肺組織淋巴細(xì)胞。
　　3、肺泡

9、灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluids，BALF)炎性細(xì)胞分類與計(jì)數(shù)
　　用含有1ml PBS的注射器經(jīng)支氣管沖洗肺組織，收集肺泡灌洗液。離心后收集上清，用于檢測(cè)細(xì)胞因子水平。100μl PBS重懸細(xì)胞沉淀，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)并制備細(xì)胞涂片。Diff-Quick染色后顯微鏡下隨機(jī)選擇視野，計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，依據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)分別計(jì)數(shù)中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞數(shù)量。
　　4、肺組織病理標(biāo)本制作及染色<

10、br>　　取模型鼠肺組織浸泡于4％多聚甲醛中固定48小時(shí)后，梯度乙醇逐級(jí)脫水，隨后經(jīng)過(guò)石蠟包埋、切片后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察模型鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及炎癥反應(yīng)情況。
　　5、細(xì)胞因子mRNA水平的檢測(cè)
　　用RNAiso plus試劑盒提取肺組織總RNA，PrimeScript TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明，采用Real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織局部Th

11、1型細(xì)胞因子IFN-γ和Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13的mRNA表達(dá)水平。
　　6、細(xì)胞因子蛋白檢測(cè)
　　按照ELISA試劑盒說(shuō)明，定量測(cè)定肺胞灌洗液中Th1型細(xì)胞因子γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)，Th2型細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（Interleukin-4，IL-4）、白細(xì)胞介素-5（Interleukin-5，IL-5）和白細(xì)胞介素-13（Interleukin-13，IL-13）的蛋

12、白含量。
　　7、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδ T細(xì)胞
　　調(diào)整小鼠肺組織淋巴細(xì)胞濃度，加入FITC anti-TCRγ/δ mAb、APC anti-CD3mAb及PE/Cy7 anti-CD69 mAb(BioLegend)，避光，4℃孵育30分鐘。2％ FBS-PBS洗滌兩次，300μl2％ FBS-PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。
　　8、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδ T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子
　　細(xì)胞經(jīng)表面染色后，2％ FBS-PBS洗

13、滌一次;向細(xì)胞懸液中加入2μl/ml的CellActivation Cocktail(BioLegend)，37℃5％ CO2培養(yǎng)箱孵育1h后，加入2μM蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(Monensin)，繼續(xù)孵育4h。2％ FBS-PBS洗滌兩次，加入250μlFixation and Permeabilization Solution(BD)，避光，4℃孵育20分鐘。Perm/WashBuffer(BD)和2％ FBS-PBS洗滌后，加入PE標(biāo)記的

14、細(xì)胞因子抗體(IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-13)或同種型抗體，避光，4℃孵育30分鐘。2％ FBS-PBS洗滌兩次，300μl2％ FBS-PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。
　　三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示。組間比較采用ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、新生期初次RSV感染加

15、重成年期再次感染時(shí)的氣道炎癥
　　為了探究初次RSV感染時(shí)間對(duì)再次感染時(shí)氣道炎癥的影響，出生1周的新生鼠或4周的成年鼠經(jīng)鼻感染RSV，所有小鼠在第8周再次經(jīng)鼻感染RSV。HE染色發(fā)現(xiàn)與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織細(xì)支氣管周圍出現(xiàn)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞總數(shù)明顯增加，其中以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞數(shù)量增加尤為顯著，提示新生期初次RSV感染加重成

16、年期再次感染時(shí)所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　2、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺組織局部Th2型細(xì)胞因子水平
　　采用ELISA法定量檢測(cè)模型鼠肺泡灌洗液中Th1/Th2型細(xì)胞因子的蛋白水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺泡灌洗液中Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13明顯升高，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平?jīng)]有明顯改變。
　　利用Re

17、al-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)模型鼠肺組織Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織局部Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5及IL-13 mRNA的表達(dá)顯著增加，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平明顯降低，推測(cè)新生期初次RSV感染通過(guò)影響Th2型細(xì)胞因子的水平左右成年期再次感染時(shí)的氣

18、道炎癥。
　　3、新生期初次RSV感染增加成年期再次感染鼠肺組織局部γδ T細(xì)胞及活化γδ T細(xì)胞數(shù)量
　　利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)模型鼠肺組織γδ T細(xì)胞總數(shù)及其活化的γδ T細(xì)胞（細(xì)胞表面標(biāo)記為:CD69+γδ T）數(shù)量。結(jié)果顯示，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，肺組織局部γδ T細(xì)胞總數(shù)以及活化的γδ T細(xì)胞的百分比和細(xì)胞數(shù)均明顯增加。
　　4、新生期初次RSV感

19、染增加成年期再次感染鼠肺組織內(nèi)Th2型γδ T細(xì)胞數(shù)量
　　通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析模型鼠肺組織局部分泌Th1/Th2型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與初次RSV感染發(fā)生在成年期的模型鼠相比，初次RSV感染發(fā)生在新生期，成年期再次感染后，分泌Th2型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞，如IL-4+γδT細(xì)胞、IL-5+γδ T細(xì)胞、IL-13+γδ T細(xì)胞數(shù)量明顯增加，然而分泌Th1型細(xì)胞因子的γδ T細(xì)胞，如IFN-γ+γδ T細(xì)胞數(shù)量卻

20、顯著降低，提示新生期RSV感染通過(guò)增加肺局部Th2型γδ T細(xì)胞數(shù)量影響再次RSV感染時(shí)所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　5、新生期初次RSV感染通過(guò)影響γδ T細(xì)胞生物學(xué)功能左右成年期再次感染時(shí)所誘發(fā)的氣道炎癥
　　為進(jìn)一步明確新生期初次RSV感染通過(guò)增加成年期再次感染鼠肺組織內(nèi)Th2型γδT細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而加重氣道炎癥，我們利用新生期初次RSV感染鼠，于成年期再次感染的前1天，感染后第2天和第3天經(jīng)鼻粘膜給予anti-TCRδ mA

21、b以去除γδ T細(xì)胞。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，anti-TCRδ mAb處理組小鼠肺組織細(xì)支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕，肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞數(shù)量明顯降低，其中嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量降低尤為顯著，同時(shí)伴有Th2型細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平明顯降低，而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ水平?jīng)]有明顯改變，提示新生期初次RSV感染通過(guò)影響肺組織局部γδ T細(xì)胞生物學(xué)活性和功能，調(diào)控成年期再次感染時(shí)所誘發(fā)的氣道炎癥。
　　結(jié)論