日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗的構(gòu)建及其表達(dá).pdf

1、目的：血吸蟲病是一種呈全球分布的、危害嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。流行于中國的主要為日本血吸蟲病，在我國其仍然是一個(gè)值得重視的嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。我國現(xiàn)有的吡喹酮化療、滅螺等血防措施雖然對血吸蟲病的防治起到重要作用，但尚不能達(dá)到完全控制甚至消除血吸蟲病的目的，而血吸蟲病疫苗的研究為此帶來了希望。由于各種不足，目前為止尚沒有一種安全、有效的血吸蟲疫苗應(yīng)用于臨床。本研究擬利用日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,Sj)14-3

2、-3和Sj32抗原編碼基因，以兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum,Bb)為“載體”，構(gòu)建日本血吸蟲重組Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗，并研究Sj14-3-3-Sj32融合基因在兩歧雙歧桿菌中的表達(dá)情況，為日本血吸蟲病疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.以本室保存的質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3和pET28α-Sj32為模板，通過PCR擴(kuò)增出Sj14-3-3和Sj32抗原編碼基

3、因，再將得到的兩個(gè)目的基
　　因用基因拼接技術(shù)（gene SOEing）進(jìn)行剪接，得到Sj14-3-3-Sj32融合基因；再將穿梭表達(dá)載體pGEX-1λT與構(gòu)建的融合基因拼接，得到重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32；采用電穿孔法將pGEX-Sj14-3-3-Sj32轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌(Escherichia coli，E.coli)BL21(DE3)中，再用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)；最后采用

4、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（ SDS-PAGE）鑒定表達(dá)產(chǎn)物，用蛋白印跡(Western blot)技術(shù)對表達(dá)蛋白的免疫原性進(jìn)行分析。
　　2.培養(yǎng)Bb菌，將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32電轉(zhuǎn)化至B b菌中，構(gòu)建重組Bb(pGEX-Sj14-3-3-Sj32)疫苗；用IPTG對疫苗進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，再通過SDS-PAGE鑒定表達(dá)產(chǎn)物，以及Western blot技術(shù)分析表達(dá)蛋白的免疫原性。
　　結(jié)果：

5、
　　1.采用基因拼接技術(shù)成功得到長度約為1750 bp的Sj14-3-3-Sj32融合基因；重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32經(jīng)雙酶切證實(shí)構(gòu)建成功；SDS-PAGE分析結(jié)果顯示重組質(zhì)粒經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物為Mr約73kDa的重組蛋白；Western blot顯示表達(dá)的重組蛋白可被Sj感染的兔血清所識別。
　　2.雙酶切和PCR均證實(shí)重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32成功轉(zhuǎn)入Bb菌中，rBb(pGEX

6、-Sj14-3-3-Sj32)疫苗構(gòu)建成功；SDS-PAGE分析顯示，重組質(zhì)粒pGEX-Sj14-3-3-Sj32經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后可在Bb菌中表達(dá)Mr約73KDa的重組蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，且在誘導(dǎo)后的2~3d表達(dá)水平較高，表達(dá)的蛋白占菌體總蛋白的8.2％；Western blot結(jié)果顯示Sj感染的兔血清可識別所表達(dá)的重組蛋白。
　　結(jié)論：
　　1.成功合成融合基因Sj14-3-3-Sj32，并與穿梭表達(dá)載體連接后得到重組質(zhì)