血吸蟲多基因非融合性膜錨定表達疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26免疫保護作用的研究和日本血吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆及其在大腸桿菌BL-21中的表達.pdf

1、本文主要從以下兩個部分展開論述：
　　第一部分:血吸蟲多基因非融合性膜錨定表達疫苗pIRES-Sj97-Sj14-Sj26免疫保護作用的研究
　　目的:大量提取并純化pIRES-Sj97-Sj14-Sj26質(zhì)粒,并用此質(zhì)粒肌注免疫BALB/c小鼠,研究其免疫原性及免疫保護作用,為日本血吸蟲病的防治尋求新的多基因組合疫苗的免疫策略。
　　方法:大量提取并純化pIRES-Sj97-Sj14-Sj26質(zhì)粒,并用此質(zhì)粒肌注免疫

2、BALB/c小鼠,同時設(shè)生理鹽水組和空載體為對照,每組20只小鼠。每隔2周加強免疫1次,共免疫3次,末次免疫2周后,每組隨機取10只小鼠,眼球取血并斷頸處死,取脾淋巴細胞及腹腔巨噬細胞。以ELISA試劑盒檢測免疫小鼠血清中總IgG抗體及脾淋巴細胞培養(yǎng)上清干擾素(IFN)-γ的水平,以淋巴細胞刺激指數(shù)(SI)反應(yīng)細胞增值能力,以NO釋放量檢測巨噬細胞吞噬活性,并以FCM分析脾淋巴細胞亞群。各組中余下每只小鼠經(jīng)腹部感染40土1條尾蚴,尾蚴攻

3、擊感染45 d后,經(jīng)腸系膜靜脈灌注法和壓片法收集血吸蟲成蟲,留取肝臟備用。分別計算每只小鼠中收集的血吸蟲成蟲數(shù),計算每組小鼠的平均成蟲數(shù),按下式計算減蟲率:減蟲率=(對照組平均獲成蟲數(shù)-實驗組平均獲成蟲數(shù))/對照組平均檢獲成蟲數(shù)×100％。稱取鼠肝總重量,按常規(guī)方法用5%氫氧化鉀消化肝組織,計算每克肝組織蟲卵數(shù)(EPG),按下式計算減卵率:減卵率=(對照組平均EPG-實驗組平均EPG)/對照組平均EPG×100%。
　　結(jié)果:免疫

4、小鼠后 ELISA法檢測抗體結(jié)果表明pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗組較各對照組誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IgG抗體(P<0.01,P<0.05).該組的脾淋巴細胞刺激指數(shù)較各對照組也有顯著增高(P<0.01),INF-γ的水平與其他兩個對照組有顯著差異(P<0.01)。CD4+和CD8+細胞百分比有明顯增高(P<0.01)。實驗組小鼠NO含量較對照組明顯提高(P<0.05)。實驗組小鼠減蟲率39.9%和減卵率43.94%均較對照組明

5、顯升高(P<0.01)
　　結(jié)論:pIRES-Sj97-Sj14-Sj26疫苗具有較強的免疫原性,能明顯增強BALB/c小鼠的免疫應(yīng)答反應(yīng),并能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生一定水平的抗日本血吸蟲感染的保護作用。
　　第二部分:日本血吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白基因的克隆及其在大腸桿菌BL-21中的表達
　　目的:構(gòu)建含日本血吸蟲脂肪酸結(jié)合蛋白基因的原核表達質(zhì)粒pET-Sj14,并將其引入大腸桿菌BL-21中的表達,為制備亞單位疫苗和檢測特異性抗

6、體和特異性細胞因子提供抗原。
　　方法:利用PCR技術(shù)擴增日本血吸蟲大陸株脂肪酸結(jié)合蛋白基因的cDNA序列,經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切后定向克隆于原核表達質(zhì)粒pET-28a,構(gòu)建成pET-Sj14質(zhì)粒,并將此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21,用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達,設(shè)置空菌對照組和0h,1h,2h,3h,4h共6組,通過SDS-PAGE觀察蛋白表達及表達量與誘導(dǎo)時間的關(guān)系。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建原核表達質(zhì)粒 pET-Sj14