日本血吸蟲SjMLP-hsp70的克隆、重組表達(dá)及其功能研究.pdf

1、血吸蟲病(schistosomiasis)是由人體血吸蟲(schistosoma)感染引起的一種人獸共患寄生蟲病，主要流行于亞洲、非洲、拉丁美洲的76個(gè)國家和地區(qū)。人體血吸蟲主要有曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni,S.m)、埃及血吸蟲(S.haematobium)和日本血吸蟲(Schistosoma japonicum,S.j)等，我國僅有日本血吸蟲病流行。據(jù)2008年全國疫情資料顯示，我國尚有454個(gè)流行縣(區(qū))，約

2、41萬慢性感染者，且主要分布在螺情難于控制的江湖洲灘地區(qū)，部分地區(qū)的疫情還有所回升趨勢，或伴隨出現(xiàn)向城市蔓延的趨勢，因此，血吸蟲病仍然是我國重點(diǎn)防治的感染性疾病之一。
　　 防治血吸蟲病的主要措施是采取人畜同步化療及易感地帶滅螺等相結(jié)合的綜合性防治方法，但由于現(xiàn)有的以吡喹酮為主要治療藥物的化療再感染率高，且耐藥性不斷嚴(yán)重化，使得血吸蟲病的防治進(jìn)展緩慢，急需在防治理論與關(guān)鍵技術(shù)方面有所突破。上世紀(jì)80年代，隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，

3、血吸蟲病疫苗研究重新獲得了人們的重視，疫苗被認(rèn)為是綜合性防治措施的有效補(bǔ)充，即“藥物化療的短效作用與疫苗接種的長效免疫預(yù)防作用相結(jié)合不僅能有效減少疾病的總體發(fā)病率，也能避免單純化療后的重復(fù)感染”。
　　 抗血吸蟲病疫苗研究歷經(jīng)了死疫苗、減毒活疫苗、基因工程蛋白疫苗及核酸疫苗幾個(gè)階段。然而，近20年來的實(shí)驗(yàn)研究已證明，這種單純以刺激Th1或Th2型體液免疫應(yīng)答為主的特異性抗原分子并不能穩(wěn)定地誘導(dǎo)動物模型高效的保護(hù)性免疫力，沒有一個(gè)

4、候選分子的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)?zāi)塬@得高于40％的保護(hù)力。致弱尾蚴疫苗的研究始于上世紀(jì)60年代末，大量實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)輻照致弱的侵襲性曼氏血吸蟲或日本血吸蟲尾蚴能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動物產(chǎn)生高達(dá)90％的保護(hù)性免疫力，以至于到現(xiàn)在仍是受公認(rèn)的最高效、穩(wěn)定的抗血吸蟲病疫苗。對曼氏血吸蟲致弱尾蚴疫苗的研究發(fā)現(xiàn)，這種保護(hù)性免疫力主要是由獲得性免疫機(jī)制介導(dǎo)的，由Th1型優(yōu)勢細(xì)胞免疫應(yīng)答向Th2型優(yōu)勢體液免疫應(yīng)答發(fā)展的持續(xù)性免疫應(yīng)答過程。
　　 為此，我們實(shí)驗(yàn)室利用雙

5、向凝膠電泳和MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定技術(shù)，比較分析紫外致弱尾蚴與正常尾蚴的可溶性蟲體總蛋白，鑒定出20個(gè)差異表達(dá)蛋白。據(jù)蛋白功能分類可大致分為5類，分別為細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白、能量代謝相關(guān)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)/調(diào)控相關(guān)蛋白、熱休克家族相關(guān)蛋白及其他功能蛋白如20S蛋白酶體等，結(jié)果提示這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與致弱尾蚴誘導(dǎo)高水平免疫力有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。在這些差異表達(dá)的蛋白分子中，熱休克蛋白家族(heat shock proteinfam

6、ily,HSP)由于其獨(dú)特的生物學(xué)功能及免疫學(xué)特性，受到人們的廣泛重視，特別是HSP70家族。在GenBank/EMBL中，至少存在3種血吸蟲HSP70蛋白序列，其序列長度分別為637aa，648aa和653aa，均含有HSP特異性功能域序列。至目前為止，有關(guān)血吸蟲HSP70的研究，主要是針對HSP70-648(一種開放讀框?yàn)?48aa的HSP70成員)，而有關(guān)其他兩種血吸蟲HSP70(HSP70-637和HSP70-653)的研究較少

7、。序列分析發(fā)現(xiàn)，血吸蟲HSP70在曼氏血吸蟲和日本血吸蟲之間高度保守，且與人類的mortalin分子的序列相似性高度70％以上。因此，我們將血吸蟲HSP70-653暫時(shí)命名為日本血吸蟲mortalin-like protein(SjMLP/hsp70)。
　　 目的：本研究旨在通過對日本血吸蟲SjMLP/hsp70的克隆、重組表達(dá)及其功能研究，為進(jìn)一步揭示該分子在紫外致弱尾蚴誘導(dǎo)高水平保護(hù)性免疫力的效應(yīng)中可能起的作用提供科學(xué)依據(jù)

8、。
　　 方法：主要是從原核和真核水平上，分別評價(jià)SjMLP/hsp70的生物學(xué)活性、抗原性及免疫保護(hù)性，并從真核水平上評價(jià)SjMLP/hsp70的佐劑效能。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴日本血吸蟲mortalin-like protein70(SjMLP/hsp70)的生物信息學(xué)分析。序列分析發(fā)現(xiàn)：SjMLP/hsp70具有DnaK功能域，屬于熱休克蛋白家族，其二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋為主；通過進(jìn)化樹分析提示，SjMLP/

9、hsp70是進(jìn)化上比較保守的蛋白，氨基酸序列上與曼氏血吸蟲熱休克蛋白70序列的相似性最高，與大腸桿菌DnaK的氨基酸序列在進(jìn)化上也是比較接近的。SjMLP/hsp70含有13個(gè)潛在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)、8個(gè)潛在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)、6個(gè)潛在的N-肉豆蔻酰位點(diǎn)、3個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)、1個(gè)潛在的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)、1個(gè)潛在的?；稽c(diǎn)；通過TargetP分析，發(fā)現(xiàn)SjMLP/hsp70定位在線

10、粒體上；通過TMpred預(yù)測發(fā)現(xiàn)，SjMLP/hsp70具有信號肽，但沒有明顯的跨膜區(qū)；SjMLP/hsp70含有8個(gè)潛在的B細(xì)胞表位及多個(gè)T細(xì)胞表位。
　　 ⑵根據(jù)GenBank中AY813185的序列信息(該序列為Sjmlp/hsp70的代表序列)，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增Sjmlp/hsp70的ORF，進(jìn)而將獲得的目的基因定向插入到pET28a質(zhì)粒中，經(jīng)PCR、酶切及測序確證該目的基因克隆成功。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，SjMLP/hsp70可分

11、為核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(nucleotide binding domain，NBD)及多肽結(jié)合位點(diǎn)(peptidebinding domain，PBD)兩個(gè)功能域，為此，分別設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SjMLP/hsp70的兩個(gè)功能域，并克隆到pET28a中，經(jīng)PCR、酶切及測序確證該目的基因克隆成功。RT-PCR結(jié)果證實(shí)目的蛋白的編碼基因能在成蟲、正常血吸蟲尾蚴、機(jī)械力斷尾后尾蚴及蟲卵中均有轉(zhuǎn)錄。含pET28a-SjMLP/hsp70質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)IPT

12、G誘導(dǎo)2h后，能明顯提高該含重組蛋白的BL21在45℃下的生存率(75％)，提示SjMLP/hsp70具有分子伴侶作用，而SjMLP/hsp70的兩個(gè)功能域單獨(dú)存在時(shí)，均不能改變宿主菌BL21的熱休克后存活率(約40％)，提示這種分子伴侶作用是通過完整蛋白分子完成的。以重組蛋白免疫小鼠，檢測免疫小鼠血清中特異性IgG水平，發(fā)現(xiàn)隨著免疫次數(shù)的增加，特異性IgG滴度快速上升，以IgG2a為主。
　　 ⑶采用切膠免疫的途徑免疫BALB

13、/c小鼠，采用30條尾蚴攻擊感染，45天后解剖小鼠，計(jì)算減蟲率和減卵率。結(jié)果顯示，與佐劑組相比，rSiMLP/hsp70免疫小鼠的減蟲率和減卵率分別為30.13％和26.60％。根據(jù)GenBank中Sjmlp/hsp70(AY813185)及SjGST26(FN321447.1)的序列信息，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增SjLP/hsp70及SjGST26的ORF，進(jìn)而將獲得的目的基因定向插入到pcDNA3.1質(zhì)粒中，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-SjML

14、P/hsp70、pcDNA3.1-SjGST26和pcDNA3.1-SjGST26-SjMLP/hsp70質(zhì)粒。以上述重組真核質(zhì)粒分別免疫BALB/c小鼠。結(jié)果顯示，pcDNA3.1-SjMLP/hsp70和pcDNA3.1-SjGST26混合免疫小鼠的脾細(xì)胞IFN-γ分泌水平明顯高于其他免疫小鼠；該組小鼠的減蟲率和減卵率分別40.43％和58.59％，也明顯高于其他免疫小鼠。
　　 結(jié)論：①通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SjMLP/

15、hsp70是定位在線粒體中的具有分子伴侶活性的蛋白；該基因能在正常尾蚴中轉(zhuǎn)錄；抗熱休克實(shí)驗(yàn)證實(shí)SjMLP/hsp70蛋白具有提高E.coli抵抗熱休克從而保護(hù)宿主菌的功能，而且證實(shí)該功能是通過具有完整結(jié)構(gòu)的蛋白來實(shí)現(xiàn)的。②對重組蛋白rSjMLP/hsp70的免疫原性研究發(fā)現(xiàn)，該重組蛋白具有免疫原性，能誘導(dǎo)免疫動物產(chǎn)生較強(qiáng)的Th1及Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)，并能對日本血吸蟲感染具有一定的保護(hù)力，提示該分子可能成為血吸蟲病疫苗候選分子，具有進(jìn)一