SIRT3在HBx介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用.pdf

1、目的：研究沉默信息調(diào)節(jié)因子3（SIRT3）在乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白介導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)中的重要作用。
　　方法：
　　1.利用熒光探針carboxy-H2DCFDA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HBV瞬時(shí)表達(dá)和 HBV穩(wěn)定復(fù)制的細(xì)胞中活性氧自由基（ROS）的水平，驗(yàn)證HBV對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用。
　　2.利用熒光探針 carboxy-H2DCFDA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)HBx突變型HBV和過(guò)表達(dá)HBx對(duì)細(xì)胞中活性氧自由基

2、（ROS）水平的影響，探討HBx在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。
　　3.利用Western blot、qRT-PCR檢測(cè)分析HBV、HBx對(duì)SIRT3蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)水平的影響，并進(jìn)一步利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)分析HBV/HBx對(duì) SIRT3啟動(dòng)子活性的調(diào)控作用。
　　4. Western blot驗(yàn)證 HBx、SIRT3的過(guò)表達(dá)，通過(guò)熒光探針carboxy-H2DCFDA和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的水平，GSH/GSSG檢測(cè)

3、試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH與GSSG的比例來(lái)分析SIRT3對(duì)HBV、HBx誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。
　　5.細(xì)胞免疫熒光、Western blot檢測(cè)HBx對(duì)細(xì)胞DNA損傷標(biāo)志物γ- H2AX形成的影響；DNA損傷定量試劑盒檢測(cè)HBx對(duì)氧化損傷的AP位點(diǎn)形成的影響；并通過(guò)檢測(cè)γ-H2AX和AP位點(diǎn)進(jìn)一步分析SIRT3在HBx導(dǎo)致的氧化損傷中的作用；MTS和流式細(xì)胞術(shù)分別分析在氧化應(yīng)激條件下HBx對(duì)細(xì)胞存活率和細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步

4、分析SIRT3在其中的保護(hù)作用。
　　6. Real-time PCR、Southern blot檢測(cè)氧化劑H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)HBV復(fù)制水平的影響；Real-time PCR、Southern blot檢測(cè)抗氧化劑NAC抑制的氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)HBV復(fù)制水平的影響；Real-time PCR、Southern blot分析SIRT3對(duì)H2O2促進(jìn)HBV復(fù)制的影響。
　　結(jié)果:
　　1. HBV穩(wěn)定復(fù)制細(xì)胞和 HB

5、V瞬時(shí)表達(dá)的細(xì)胞中活性氧自由基的水平明顯增高。
　　2. HBV基因組中HBx突變能明顯降低HBV對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的誘導(dǎo)作用，HBx過(guò)表達(dá)可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
　　3. HBx下調(diào) SIRT3的 mRNA、蛋白質(zhì)表達(dá)水平；HBx明顯抑制SIRT3的啟動(dòng)子活性。
　　4. SIRT3拮抗HBx引起細(xì)胞活性氧自由基水平增加和GSH/GSSG比例失衡。
　　5. HBx表達(dá)增加了γ- H2AX和AP位點(diǎn)的形成，

6、SIRT3過(guò)表達(dá)減弱HBx對(duì)γ-H2AX和AP位點(diǎn)形成的促進(jìn)作用；氧化應(yīng)激條件下HBx表達(dá)降低了細(xì)胞存活率，誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡，SIRT3過(guò)表達(dá)減弱了 HBx對(duì)細(xì)胞存活和凋亡的影響。
　　6.氧化劑H2O2促進(jìn)HBV的復(fù)制；抗氧化劑NAC抑制HBV的復(fù)制；SIRT3能夠拮抗氧化劑H2O2對(duì)HBV復(fù)制的促進(jìn)作用。
　　結(jié)論：
　　SIRT3減弱HBx介導(dǎo)的氧化應(yīng)激對(duì)宿主細(xì)胞造成的氧化損傷，并同時(shí)能減弱氧化應(yīng)激對(duì)HBV復(fù)制的促