ApoE---小鼠頸總動(dòng)脈粥樣硬化不同時(shí)間點(diǎn)自噬水平變化的研究.pdf

1、目的：
　　探究在載脂蛋白E基因敲除小鼠（即ApoE-/-小鼠）頸總動(dòng)脈粥樣硬化的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)自噬水平的變化情況。
　　方法：
　?。?）40只6周齡的SPF級(jí)雄性ApoE-/-小鼠，先給與普通飼料喂養(yǎng)2周，隨后隨機(jī)分成對(duì)照組（10只）與模型組（30只）。對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)（ApoE-/-小鼠右側(cè)頸總動(dòng)脈旁放置硅膠管）處理，而后繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)8周；模型組給與手術(shù)（右側(cè)頸總動(dòng)脈外套置硅膠管）處理，手術(shù)后隨機(jī)分成3組（2周組

2、、4周組、8周組），每組各10只，并且均換成高脂飼料，分別喂養(yǎng)2周、4周、8周后處死。
　?。?）分離并剪斷ApoE-/-小鼠的股動(dòng)脈進(jìn)行取血，檢測(cè)每只ApoE-/-小鼠血清中甘油三脂（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL_c）的含量。
　?。?）ApoE-/-小鼠取血后處死，分離取出套管側(cè)頸總動(dòng)脈，固定后做石蠟切片，HE染色，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡觀察每組血管壁結(jié)構(gòu)的變化。
　?。?）離體的套管側(cè)頸總動(dòng)脈經(jīng)固

3、定后，做超薄切片并染色，應(yīng)用透射電鏡觀察每組小鼠頸總動(dòng)脈組織巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　?。?）提取各組ApoE-/-小鼠套管側(cè)頸總動(dòng)脈組織的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)每組小鼠頸總動(dòng)脈組織中ATG5、Beclin1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量。
　?。?）提取各組 ApoE-/-小鼠套管側(cè)頸總動(dòng)脈組織中的總蛋白，應(yīng)用 western blot檢測(cè)每組小鼠頸總動(dòng)脈組織中ATG5、Beclin1蛋白

4、的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。?）與對(duì)照組相比較，模型組ApoE-/-小鼠的血脂水平均升高（P＜0.05）；模型組中TG和LDL_c的表達(dá)水平隨著套管手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高（P＜0.05）。
　?。?）組織病理學(xué)觀察顯示，對(duì)照組ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈管壁結(jié)構(gòu)比較完整，且彈性膜較為豐富。2周組小鼠管壁結(jié)構(gòu)仍較完整，但是一小部分管壁增厚并見有少量細(xì)胞浸潤(rùn)。4周組小鼠管壁結(jié)構(gòu)較為凌亂，而且見有泡沫細(xì)胞、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)

5、。8周組小鼠管壁明顯增厚而且有大量泡沫細(xì)胞、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，彈性膜結(jié)構(gòu)破壞且明顯減少，管腔狹窄。
　?。?）透射電鏡觀察顯示，與對(duì)照組相比較，模型組ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈組織巨噬細(xì)胞中的脂滴和自噬體數(shù)目均明顯增多，4周組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂滴和自噬體數(shù)目明顯多于2 周組，8周組巨噬細(xì)胞內(nèi)的脂滴數(shù)目明顯多于4周組，但其自噬體數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于4周組。（4）實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，2周組ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈組織中ATG5、Be

6、clin1的mRNA的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05），4周組和8周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；4周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達(dá)均高于2周組和8周組，而且，8周組ATG5、Beclin1的mRNA的表達(dá)高于2周組（P＜0.05）。（5）western blot結(jié)果顯示，2周組ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈組織中ATG5、Beclin1蛋白的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組相比較無明顯差

7、異（P＞0.05），4周組和8周組ATG5、Beclin1蛋白的表達(dá)均高于對(duì)照組（P＜0.05）；4周組ATG5、Beclin1蛋白的表達(dá)均高于2周組和8周組，而且，8周組ATG5、Beclin1蛋白的表達(dá)高于2周組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　在 ApoE-/-小鼠頸總動(dòng)脈粥樣硬化的疾病過程中，自噬在起始階段不斷激活，自噬水平逐漸升高，但是，自噬水平在動(dòng)脈粥樣硬化的某一時(shí)間點(diǎn)（本實(shí)驗(yàn)中為套管手術(shù)4周后）將會(huì)達(dá)到峰值，