脂聯(lián)素改善三轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶能力損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討脂聯(lián)素（Adiponectin, APN）預(yù)處理能否有效改善9月齡APP/PS1/tau三轉(zhuǎn)基因阿爾茨海默?。?xTg-AD）模型小鼠的新物體識(shí)別、工作記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷，緩解其焦慮情緒，逆轉(zhuǎn)其在體海馬突觸可塑性傷害，影響其海馬內(nèi)促炎因子NF-κB，IL-1β、TNF-α及抗炎因子IL-10的表達(dá)水平。從而證實(shí)脂聯(lián)素在AD病程中是否能發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其機(jī)制是否與減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)有關(guān)。
　　方法

2、：
　　實(shí)驗(yàn)選用9月齡雄性3xTg-AD小鼠和其背景鼠C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為四組，每組8只，分別為：野生對(duì)照組（WT+Saline）、野生給藥組（WT+APN）、三轉(zhuǎn)模型組（3xTg+Saline）和三轉(zhuǎn)給藥組（3xTg+APN）。連續(xù)10天經(jīng)側(cè)腦室分別注射0.1μg/4μl的脂聯(lián)素或等體積的生理鹽水，然后開始行為學(xué)實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)期間持續(xù)給藥直至斷頭取海馬組織。
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)分為四部分依次進(jìn)行：（1）曠場實(shí)驗(yàn)：在安靜

3、環(huán)境下，把小鼠放入曠場中央自由探索5 min，記錄小鼠運(yùn)動(dòng)的總距離及其在中央?yún)^(qū)域或外周區(qū)域的活動(dòng)時(shí)間占總時(shí)間的百分比。（2）新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：曠場實(shí)驗(yàn)后第2天進(jìn)行。在熟悉實(shí)驗(yàn)階段，將兩個(gè)完全相同的物體放入曠場，再將小鼠從兩物體對(duì)側(cè)壁的中點(diǎn)貼壁放入，讓其自由探索10 min。小鼠休息5 h后，進(jìn)行測試實(shí)驗(yàn)，將其中一個(gè)物體換為材質(zhì)相同、顏色形狀不同的新物體，讓小鼠再自由探索10 min。分析指標(biāo)包括物體識(shí)別指數(shù)和辨別指數(shù)，物體識(shí)別指數(shù)=探索新

4、物體時(shí)間或探索舊物體時(shí)間/(探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間)×100％，辨別指數(shù)=（探索新物體的時(shí)間-探索舊物體的時(shí)間）/（探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間）×100%。（3）Y迷宮自發(fā)交替實(shí)驗(yàn)：將小鼠放入Y迷宮的三臂交匯區(qū)自由活動(dòng)8 min，記錄小鼠進(jìn)入各臂的總次數(shù)和順序，并計(jì)算其自發(fā)交替正確率。（4）Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)：首先進(jìn)行5天的定位航行實(shí)驗(yàn)，每天將小鼠隨機(jī)放入4個(gè)象限。記錄其游泳軌跡、游泳速度和逃避潛伏期（找到水下平臺(tái)所用時(shí)

5、間）。第6天上午進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄60 s內(nèi)小鼠的運(yùn)動(dòng)軌跡及在目標(biāo)象限的活動(dòng)時(shí)間；下午進(jìn)行可視平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠找到平臺(tái)的時(shí)間和游泳速度。
　　行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行在體海馬場電位記錄實(shí)驗(yàn)。將小鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，定位其海馬CA1區(qū)并將綁定的刺激電極和記錄電極插入。首先記錄30 min場興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potentials, fEPSPs），然后給予配對(duì)刺

6、激記錄雙脈沖易化(paired-pulse facilitation, PPF），最后通過高頻刺激（high-frequency stimulation, HFS）誘導(dǎo)長時(shí)程增強(qiáng)（long term potentiation, LTP）并記錄60 min。通過比較HFS前后各組fEPSPs的斜率來反映AD相關(guān)基因突變和脂聯(lián)素預(yù)處理是否影響突觸可塑性；通過比較各組的PPF值，來確定是否有突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放的改變。
　　在體LTP實(shí)驗(yàn)

7、后，將小鼠斷頭取腦，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測各組小鼠海馬內(nèi)促炎因子NF-κB、IL-1β、TNF-α和抗炎因子IL-10的表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。?）脂聯(lián)素可以明顯改善9月齡3xTg-AD小鼠的識(shí)別記憶、工作記憶和空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷，并緩解其焦慮情緒。在曠場實(shí)驗(yàn)中，與WT+Saline組相比，3xTg+Saline組小鼠在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的時(shí)間百分比明顯降低（P<0.001），而在外周區(qū)域活動(dòng)的時(shí)間百分比明顯升

8、高（P<0.001），表明3xTg小鼠出現(xiàn)焦慮情緒；給予APN后，3xTg小鼠在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的時(shí)間增加，而在外周活動(dòng)的時(shí)間減少（P<0.01），其焦慮情緒得到緩解。在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，除3xTg+Saline組小鼠的新舊物體識(shí)別指數(shù)之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外，其余各組小鼠的新物體識(shí)別指數(shù)明均顯高于舊物體識(shí)別指數(shù)（P<0.05）。同時(shí)，3xTg+Saline組小鼠的辨別指數(shù)明顯低于WT+Saline組（P<0.01）， APN預(yù)處理后提高了3x

9、Tg小鼠的辨別指數(shù)（P<0.01），表明APN能夠有效改善3xTg小鼠的新物體識(shí)別記憶損傷。在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠的總進(jìn)臂次數(shù)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但3xTg+Saline組小鼠的自發(fā)交替正確率明顯低于WT+Saline組和3xTg+APN小鼠（P<0.01），提示脂聯(lián)素能夠改善3xTg小鼠的工作記憶損傷。在Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)中，各組小鼠的逃避潛伏期均隨訓(xùn)練天數(shù)增加而明顯縮短。在第2-5天，3xTg+Saline組小鼠找到平臺(tái)所

10、需時(shí)間明顯長于WT+Saline組（P＜0.05）；在第3-5天，3xTg+APN組小鼠的逃避潛伏期明顯短于3xTg+Saline組小鼠（P＜0.05）。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，3xTg+Saline組小鼠在目標(biāo)象限的活動(dòng)時(shí)間百分比明顯少于其余三組（P＜0.001），且各組小鼠在6天中的游泳速度和到達(dá)可視平臺(tái)的時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），表明脂聯(lián)素預(yù)處理改善了3xTg小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損傷。
　　（2）脂聯(lián)素逆轉(zhuǎn)9月齡3xTg

11、-AD小鼠的海馬突觸可塑性傷害。各組小鼠在HFS前30 min所記錄的fEPSPs斜率和配對(duì)脈沖刺激所引起的PPF比值均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。當(dāng)給予HFS后，在四組小鼠均成功誘導(dǎo)出LTP。但在HFS后20 min開始，3xTg+Saline組小鼠fEPSPs的斜率明顯降低，在HFS后30 min和60 min，3xTg+Saline組小鼠fEPSPs的斜率都明顯低于WT+Saline組和3xTg+APN組小鼠（P<0.05）。

12、以上結(jié)果表明，AD相關(guān)基因突變和脂聯(lián)素預(yù)處理均未影響基礎(chǔ)突觸傳遞和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放，但脂聯(lián)素預(yù)處理可以有效逆轉(zhuǎn)3xTg小鼠的海馬突觸可塑性損傷。
　?。?）脂聯(lián)素減輕了3xTg-AD小鼠海馬內(nèi)的神經(jīng)炎性反應(yīng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與WT+Saline組相比，3xTg+Saline組小鼠海馬內(nèi)促炎因子NF-κB、IL-1β和TNF-α的表達(dá)量明顯升高（P<0.01），而抗炎因子IL-10的表達(dá)量卻明顯降低（P＜0.

13、001）。給予APN后，3xTg-AD小鼠海馬內(nèi)NF-κB、IL-1β和TNF-α的表達(dá)量有所下降（P<0.05），而IL-10的表達(dá)量有所升高（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　9月齡3xTg-AD小鼠的識(shí)別記憶、短期工作記憶和長期空間學(xué)習(xí)記憶能力明顯損傷，并出現(xiàn)焦慮情緒。同時(shí)，3xTg-AD小鼠還表現(xiàn)出在體海馬LTP的抑制和海馬內(nèi)神經(jīng)炎性反應(yīng)。給予脂聯(lián)素后，能夠改善3xTg-AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力損傷、緩解其焦慮情緒和逆