簡(jiǎn)介：骨缺損在臨床上十分普遍，而由先天骨發(fā)育不良或發(fā)育畸形以及腫瘤、炎癥、外傷等原因造成的大面積以及極限骨缺損仍是正頜外科、口腔頜面外科以及口腔種植科醫(yī)生所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。骨形態(tài)發(fā)生蛋白BMP是一組具有高度保守結(jié)構(gòu)的二聚體蛋白，屬于轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子TGF超家族成員，在促進(jìn)骨再生研究的領(lǐng)域中是主要的細(xì)胞因子之一。尤其是BMP2同源二聚體和BMP7同源二聚體，先后得到FDA認(rèn)證，可用于脊椎融合術(shù)、修復(fù)骨缺損、加速骨聯(lián)合等方面的輔助治療。BMP27異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP27能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值并且BMP27在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過(guò)程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。近期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立小型豬顱頂骨的極限種植體周?chē)侨睋p模型，通過(guò)MICROCT的掃描檢測(cè)和新生骨小梁的數(shù)量、厚度、距離以及新骨結(jié)構(gòu)模型等參數(shù)分析，BMP27誘導(dǎo)的新生骨組織量顯著多于BMP2和BMP7組，并且BMP27誘導(dǎo)的新生骨組織結(jié)構(gòu)最接近于缺損周邊正常骨組織。此外，有文獻(xiàn)報(bào)道全反式維甲酸ALLTRANSRETINOICACID，ATRA能夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。但亦有報(bào)道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細(xì)胞成骨分化并促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。故本實(shí)驗(yàn)著重研究ATRA與低劑量BMP27對(duì)不同種類(lèi)細(xì)胞成骨分化的影響，及二者聯(lián)合應(yīng)用能否對(duì)細(xì)胞成骨分化產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)作用，進(jìn)一步有效促進(jìn)成骨分化和新骨形成。第一部分BMP27異源二聚體與全反式維甲酸對(duì)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1的作用目的BMP27異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP27能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值并且BMP27在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過(guò)程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。全反式維甲酸ALLTRANSRETINOICACID，ATRA能夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。但亦有報(bào)道指出ATRA和BMP協(xié)同抑制細(xì)胞成骨分化并促進(jìn)細(xì)胞成脂分化。本研究旨在探討RHBMP27異源二聚體和ATRA分別對(duì)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導(dǎo)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1成骨的作用及其體外誘導(dǎo)成骨發(fā)生的具體生物學(xué)功能特點(diǎn)。材料和方法以不同濃度的RHBMP27異源二聚體5NGML，50NGML及ATRA（1UM）作用于小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1，并設(shè)立對(duì)照組，檢測(cè)RHBMP27和ATRA及二者聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞MC3T3E1成骨發(fā)生過(guò)程中的作用，檢測(cè)成骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)。用熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞增殖后的細(xì)胞個(gè)數(shù)用比色法檢測(cè)細(xì)胞成骨分化早期指標(biāo)堿性磷酸酶ALP活性用ELISA方法檢測(cè)成骨分化晚期指標(biāo)細(xì)胞骨鈣素OCN的分泌量用RTPCR法檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因ALP、OCN、COL1、RUNX2的表達(dá)水平用茜素紅染色觀察并計(jì)量細(xì)胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)面積及吸光度。結(jié)果細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)1天時(shí)，僅單純50NGMLBMP27組細(xì)胞數(shù)明顯增加，而其他5組并未發(fā)現(xiàn)明顯的抑制或促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。第4天時(shí)，單純ATRA對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用，但ATRA對(duì)細(xì)胞增殖的這種抑制作用，可以通過(guò)添加5NGML或50NGMLBMP27予以補(bǔ)償。而5NGML或50NGMLBMP27單獨(dú)作用下，細(xì)胞增殖均較其他組顯著。但ATRA未明顯影響細(xì)胞ALP活性，無(wú)論是否添加ATRA，BMP27在任一時(shí)間點(diǎn)均可明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP活性表達(dá)，并且具有濃度依賴(lài)性。ATRA對(duì)細(xì)胞OCN表達(dá)的影響較其對(duì)細(xì)胞增殖的影響相似，在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制細(xì)胞OCN表達(dá)，第4天時(shí)，5NGMLBMP27即可完全拮抗ATRA對(duì)OCN表達(dá)所產(chǎn)生的抑制作用，使而二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)OCN表達(dá)水平與空白對(duì)照組OCN表達(dá)水平相近。然而在第7天時(shí)，其對(duì)ATRA所產(chǎn)生的拮抗作用有所減弱?？傊?，ATRA在任一時(shí)間點(diǎn)均可抑制BMP27引起的OCN的表達(dá)。茜素紅染色結(jié)果顯示，1UMATRA可以明顯抑制細(xì)胞外基質(zhì)礦化。5NGMLBMP27ATRA組細(xì)胞外基質(zhì)礦化面積明顯低于空白對(duì)照組，而50NGMLBMP27則可完全拮抗ATRA對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)礦化所產(chǎn)生的的抑制作用，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)細(xì)胞外基質(zhì)礦化面積約為空白對(duì)照組的25倍。單純50NGMLBMP27作用下細(xì)胞外基質(zhì)礦化最為明顯?；蜓芯拷Y(jié)果顯示在第一天，無(wú)論是否添加BMP27，ATRA均顯著抑制RUNX2基因的表達(dá)。然而，單純ATRA則可在第4天和第7天時(shí)明顯促進(jìn)RUNX2的基因表達(dá)。BMP27對(duì)RUNX2基因表達(dá)的促進(jìn)作用則表現(xiàn)為濃度依賴(lài)型。任一時(shí)間點(diǎn)時(shí)，ATRA均可明顯抑制Ⅰ型膠原基因的表達(dá)，而5NGMLBMP27在任一時(shí)間均可完全拮抗由ATRA產(chǎn)生的這種對(duì)Ⅰ型膠原基因表達(dá)的抑制作用。50NGMLBMP27在第一天和第7天時(shí)亦可產(chǎn)生與5NGMLBMP27相同的作用，并且在第四天時(shí)50NGMLBMP27可明顯促進(jìn)Ⅰ型膠原基因的表達(dá)。與ALP活性表達(dá)不同的是，ATRA在任一時(shí)間點(diǎn)均抑制ALP基因的表達(dá)。5NGML和50NGMLBMP27均能拮抗ATRA對(duì)細(xì)胞ALP基因所產(chǎn)生的抑制作用，并促進(jìn)細(xì)胞ALP基因的表達(dá)。單純BMP27對(duì)細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平則具有明顯促進(jìn)作用，且具有一定的濃度依賴(lài)性，但在第4天和第7天ATRA均能明顯抑制BMP27所誘導(dǎo)的OCN基因表達(dá)。任一時(shí)間點(diǎn)，單純ATRA均可明顯抑制OCN基因表達(dá)，5NGMLBMP27即可完全拮抗由ATRA所產(chǎn)生的抑制作用，而50NGMLBMP27不僅可以完全拮抗ATRA所產(chǎn)生的拮抗作用，而且可明顯促進(jìn)細(xì)胞OCN基因的表達(dá)。無(wú)論是否添加ATRA，BMP27對(duì)細(xì)胞OCN基因表達(dá)的促進(jìn)作用均呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴(lài)性。而第4天和第7天時(shí)，ATRA均能明顯抑制由5或50NGMLBMP27所引起的OCN基因的表達(dá)。結(jié)論ATRA抑制小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1的成骨分化，BMP27促進(jìn)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1的成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性ATRA與BMP27間并不存在協(xié)同誘導(dǎo)小鼠原成骨細(xì)胞MC3T3E1成骨分化的作用，而B(niǎo)MP27可拮抗ATRA對(duì)細(xì)胞成骨分化所產(chǎn)生的抑制作用并明顯促進(jìn)細(xì)胞成骨分化。第二部分BMP27異源二聚體與全反式維甲酸對(duì)SD大鼠BMSC成骨分化的作用目的BMP27異源二聚體較BMP同源二聚體有更高效的誘導(dǎo)成骨作用，其誘導(dǎo)的細(xì)胞ALP活性以及體內(nèi)成骨量是相應(yīng)BMP同源二聚體的數(shù)倍至數(shù)十倍。同時(shí)，BMP同源二聚體在破骨發(fā)生中也發(fā)揮了顯著作用，刺激和調(diào)控破骨細(xì)胞分化，刺激破骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)成熟破骨細(xì)胞的骨吸收功能等。相比與BMP2和BMP7，BMP27能在顯著較低的濃度起效誘導(dǎo)細(xì)胞成骨發(fā)生，并在較低濃度范圍內(nèi)達(dá)到與BMP2和BMP7在較高濃度范圍內(nèi)所達(dá)到的作用效果峰值并且BMP27在誘導(dǎo)細(xì)胞破骨發(fā)生過(guò)程中并不存在這一特點(diǎn)，即在低濃度范圍內(nèi)促進(jìn)破骨發(fā)生的程度仍然較低，因而可獲得更大的成骨凈效應(yīng)。全反式維甲酸ALLTRANSRETINOICACID，ATRA能夠上調(diào)多種細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、干細(xì)胞等的成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)基質(zhì)礦化。同時(shí)，也有研究報(bào)道指出ATRA與BMP2聯(lián)合應(yīng)用能夠協(xié)同誘導(dǎo)脂肪源細(xì)胞的成骨分化，促進(jìn)顱骨成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的成骨分化，以及通過(guò)細(xì)胞介導(dǎo)的組織工程學(xué)技術(shù)促進(jìn)體內(nèi)的成骨細(xì)胞募集和骨組織改建更新。本研究旨在探討RHBMP27異源二聚體和ATRA誘導(dǎo)大鼠原代BMSC成骨分化的作用，二者之間是否存在協(xié)同誘導(dǎo)小大鼠原代BMSC成骨分化作用及其體外誘導(dǎo)成骨發(fā)生的具體生物學(xué)功能特點(diǎn)。材料和方法獲取SD大鼠脛骨及股骨原代BMSCS，流失細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞純度后以不同濃度的RHBMP27異源二聚體5NGML，50NGML及ATRA（1UM）作用于大鼠原代BMSC成骨分化，并設(shè)立對(duì)照組，檢測(cè)RHBMP27和ATRA及二者聯(lián)合應(yīng)用在誘導(dǎo)大鼠原代BMSC成骨發(fā)生過(guò)程中的作用，檢測(cè)成骨發(fā)生各階段的相關(guān)指標(biāo)。用熒光定量法檢測(cè)細(xì)胞增殖后的各組DNA含量用比色法檢測(cè)細(xì)胞成骨分化早期指標(biāo)堿性磷酸酶ALP活性用ELISA方法檢測(cè)成骨分化晚期指標(biāo)細(xì)胞骨鈣素OCN的分泌量用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR法檢測(cè)細(xì)胞成骨相關(guān)基因（ALP、OCN、RUNX2）的表達(dá)水平用茜素紅染色觀察并計(jì)量細(xì)胞礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞外基質(zhì)礦化結(jié)節(jié)面積。結(jié)果單純ATRA作用下，細(xì)胞增殖明顯被抑制，第七天DNA含量?jī)H較第四天略有提升，而B(niǎo)MP27可以對(duì)抗ATRA對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生的抑制作用，在第四天，ATRA聯(lián)合應(yīng)用5NGML及50NGML的BMP27較單獨(dú)應(yīng)用ATRA，均可以明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖，而在第七天時(shí)，與單獨(dú)應(yīng)用ATRA相比，ATRA與50NGMLBMP27聯(lián)合應(yīng)用亦使DNA含量明顯增高。不同于ATRA和BMP27對(duì)細(xì)胞增殖的影響，ATRA和BMP27均能明顯促進(jìn)BMSC在第四天及第七天ALP活性表達(dá)。任一時(shí)間點(diǎn)，ATRA與BMP275NGML，50NGML聯(lián)合作用下，均可明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP的活性表達(dá)。第七天，ATRA與50NGML協(xié)同促進(jìn)BMSCALP活性表達(dá)水平則達(dá)到空白組ALP活性表達(dá)水平的701倍。BMP27對(duì)細(xì)胞OCN水平具有促進(jìn)作用，并隨BMP27濃度的增加而增加。然而，任一時(shí)間點(diǎn)，單純ATRA作用時(shí)明顯抑制了OCN的表達(dá)。在ATRA作用下，BMP27對(duì)OCN表達(dá)水平的作用則表現(xiàn)為濃度和時(shí)間依賴(lài)性。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)14天后，僅BMP2750NGML組出現(xiàn)基質(zhì)礦化，細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)21天后，空白對(duì)照組及單純ATRA作用組僅可檢測(cè)到極少量的鈣鹽沉積，可見(jiàn)單純ATRA對(duì)BMSC細(xì)胞礦化僅有極小的影響。BMP27含或不合ATRA均能明顯促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)礦化，并且細(xì)胞外基質(zhì)礦化面積隨BMP27濃度的增加而增加。ATRA明顯下調(diào)5NGMLBMP27所誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)礦化，但這種抑制作用在50NGMLBMP27時(shí)則并不存在。單純5NGMLBMP27或者ATRA刺激培養(yǎng)7天后才能明顯促進(jìn)RUNX2基因的表達(dá)。50NGMLBMP27在細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)4天和7天時(shí)均能明顯促進(jìn)RUNX2基因的表達(dá)，與單純ATRA組及5NGMLBMP27ATRA組相比，50NGMLBMP27ATRA組則明顯促進(jìn)RUNX2基因的表達(dá)。與ALP活性表達(dá)不同的是，在第4天時(shí)，ATRA并沒(méi)有明顯影響ALP基因的表達(dá)，在第7天時(shí)，ATRA對(duì)ALP基因的表達(dá)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。單純5NGMLBMP27和50NGMLBMP27則在細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)第7天時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)作用。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)第4天時(shí)，與空白對(duì)照組相比，ATRA和任一濃度的BMP27共同作用均能明顯促進(jìn)ALP基因的表達(dá)。與第4天相比，ATRA和50NGMLBMP27在第7天時(shí)明顯促進(jìn)細(xì)胞ALP基因表達(dá)。細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)7天時(shí)，空白對(duì)照組及單純BMP27作用組的細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平較4天時(shí)明顯上升，在第7天時(shí)，任何BMP27濃度0NGML，5NGML，50NGML下ATRA均能明顯抑制細(xì)胞OCN基因表達(dá)水平，而這種抑制現(xiàn)在在細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)4天時(shí)并未出現(xiàn)。結(jié)論BMP27促進(jìn)SD大鼠BMSCS成骨分化，并呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。BMP27和ATRA協(xié)同誘導(dǎo)SD大鼠BMSCS成骨早期分化，促進(jìn)ALP活性表達(dá)，但ATRA抑制BMSC中晚期成骨分化，抑制細(xì)胞外基質(zhì)礦化，而B(niǎo)MP27促進(jìn)BMSC成骨分化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)礦化，并呈濃度依賴(lài)性，ATRA可抑制低濃度BMP27誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的能力，而相對(duì)高濃度BMP27誘導(dǎo)細(xì)胞成骨分化的能力不受ATRA影響。

簡(jiǎn)介：目的探討經(jīng)口內(nèi)鏡下肌切開(kāi)術(shù)PERALENDOSCOPICMYOTOMY，POEM治療賁門(mén)失弛緩癥ACHALASIA，AC的臨床療效。方法回顧性分析2012年2月至2014年3月蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院消化內(nèi)科確診為AC并接受POEM治療的64例患者，其中男30例，女34例，年齡1777449±143歲，平均病程61年；漢族42例，回族9例，維吾爾族9例，哈薩克族4例；體質(zhì)量指數(shù)BODYMASSINDEXBMI＜185偏瘦25例，185249正常32例，＞25超重7例。既往接受肉毒素治療5例，支架或球囊擴(kuò)張9例，外科手術(shù)2例。觀察患者手術(shù)前后ECKARDT評(píng)分及食管動(dòng)力測(cè)壓結(jié)果評(píng)判POEM手術(shù)治療的臨床療效。結(jié)果64例AC患者中63例成功完成POEM手術(shù)，無(wú)嚴(yán)重并發(fā)癥，手術(shù)時(shí)間812±20130120MIN，黏膜下隧道切開(kāi)長(zhǎng)度117±181015CM，環(huán)形肌切開(kāi)長(zhǎng)度長(zhǎng)階段為92±088511CM，食道部分長(zhǎng)度70±07658CM，胃部分長(zhǎng)度22±0423CM；短階段為50±05456CM，食道部分長(zhǎng)度29±02253CM，胃部分長(zhǎng)度21±0423CM。術(shù)后隨訪56例7例失訪，隨訪1236個(gè)月，平均186月隨訪1236186±92個(gè)月，除1例外科術(shù)后芝加哥Ⅰ類(lèi)病人外，55例患者吞咽困難癥狀無(wú)復(fù)發(fā)，進(jìn)食順利，無(wú)胸骨后疼痛及明顯反流現(xiàn)象，手術(shù)療效確切。行食管測(cè)壓的23例患者術(shù)后食管下括約肌LES平均靜息壓187±59MMHG，較術(shù)前506±134MMHG明顯降低P＜001；56例患者術(shù)后1236個(gè)月隨訪ECKARDT評(píng)分14±10分較術(shù)前70±21分明顯降低P＜001，療效顯著。長(zhǎng)階段、短階段環(huán)形肌切開(kāi)臨床療效及ECKARDT評(píng)分無(wú)差異。隨訪長(zhǎng)階段35例、短階段21例環(huán)形肌切開(kāi)之間ECKARDT評(píng)分無(wú)差異P＞005。結(jié)論P(yáng)OEM作為一項(xiàng)新興微創(chuàng)技術(shù)，治療AC短期臨床療效確切，可以迅速緩解AC患者吞咽困難等臨床癥狀，長(zhǎng)期療效及遠(yuǎn)期并發(fā)癥仍有待大樣本隨訪及監(jiān)測(cè)。

簡(jiǎn)介：網(wǎng)化生物陶瓷支架由于良好的三維貫通結(jié)構(gòu)和骨傳導(dǎo)性，可以作為細(xì)胞粘附、遷移、分化和增殖的三維模板，有利于血管化的形成并引導(dǎo)組織的生長(zhǎng)，在組織工程支架領(lǐng)域已經(jīng)得到非常廣泛的應(yīng)用。但是由于陶瓷的脆性，其力學(xué)性能一直無(wú)法滿(mǎn)足體內(nèi)承力部位植入的需要，大大限制了它的臨床應(yīng)用。因此，改善網(wǎng)化生物陶瓷支架的力學(xué)性能就變得尤為重要。本文主要采用有機(jī)泡沫浸漬法制備網(wǎng)化羥基磷灰石HA陶瓷支架，通過(guò)比較初始粉體的形狀優(yōu)化制備工藝，然后對(duì)網(wǎng)化支架進(jìn)行力學(xué)和生物學(xué)性能的優(yōu)化。分別采用熱等靜壓和聚合物浸涂法改善支架力學(xué)性能；同時(shí)，為了改善網(wǎng)化支架的生物學(xué)性能，利用仿生礦化技術(shù)，對(duì)網(wǎng)化TI金屬支架、HAPCL和HAPDLLA支架進(jìn)行了表面生物活化，以改善支架對(duì)細(xì)胞等的親和性。此外，采用擠壓法成功改善了顆粒造孔制備的多孔HA陶瓷支架的貫通性，達(dá)到了多孔結(jié)構(gòu)網(wǎng)化目的，同時(shí)具有更高的力學(xué)性能，并系統(tǒng)考察了造孔顆粒大小等因素對(duì)支架力學(xué)性能的影響。采用粘度計(jì)、體視顯微鏡、掃描電子顯微鏡SEM、X射線衍射儀XRD、和抗壓強(qiáng)度測(cè)試等分析手段，系統(tǒng)地研究了網(wǎng)化HA支架的性能。獲得的主要結(jié)論如下1采用有機(jī)泡沫浸漬法成功地制備了網(wǎng)化羥基磷灰石HA陶瓷支架，研究了不同顆粒形態(tài)的HA粉體對(duì)網(wǎng)化HA陶瓷支架力學(xué)強(qiáng)度的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明球形HA粉體所制備的網(wǎng)化陶瓷具有最佳的燒結(jié)性能和力學(xué)性能，這是由于球形HA粉體顆粒間具有最佳的堆積效果，所配制的漿料具有最高的粘度，因此在樣品的浸漬涂覆過(guò)程中，泡沫上涂覆的HA漿料最多，因此最終燒結(jié)的網(wǎng)化支架的骨架最厚。2采用了熱等靜壓、PCL涂層涂覆和PDLLA涂層涂覆等方法改善網(wǎng)化HA陶瓷支架的力學(xué)性能，研究了不同方法改善支架力學(xué)性能的機(jī)理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1三種方法均能有效地改善網(wǎng)化HA陶瓷支架的力學(xué)性能，采用聚合物涂覆法對(duì)支架的力學(xué)性能改善更明顯；2熱等靜壓法對(duì)支架力學(xué)性能的改善是因?yàn)樵诙螣Y(jié)過(guò)程中，晶粒進(jìn)一步致密化，使支架內(nèi)部的微孔和微裂紋明顯減少；3網(wǎng)化HA陶瓷支架涂覆聚己內(nèi)酯PCL和聚乳酸PDLLA涂層，不僅在表面能觀察到聚合物，在網(wǎng)化多孔結(jié)構(gòu)骨架微孔內(nèi)部也有一些滲透的聚合物，從而實(shí)現(xiàn)了聚合物與陶瓷骨架的復(fù)合，在一定程度上降低支架的脆性，達(dá)到補(bǔ)強(qiáng)增韌的效果；3利用仿生礦化技術(shù)對(duì)網(wǎng)化支架的多孔結(jié)構(gòu)上進(jìn)行CAP涂層修飾，改善其生物學(xué)性能1通過(guò)在模擬體液SBF中仿生礦化，成功地在多孔TI支架多孔結(jié)構(gòu)表面沉積具有納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層，支架的三維貫通結(jié)構(gòu)不變；2通過(guò)在過(guò)飽和的鈣磷溶液SCPS中仿生礦化，成功在HAPCL復(fù)合支架表面修飾具有片層狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層；3在PDLLA涂層中添加CASO4和硫酸軟骨素CS顆?？梢猿晒Φ馗纳茝?fù)合支架的生物活性，在SBF中仿生礦化7天和14天后支架表面出現(xiàn)納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的CAP涂層，添加CASO4的復(fù)合支架的生物活性更好；SBF的濃度會(huì)影響仿生礦化CAP涂層的微觀結(jié)構(gòu)，在1倍SBF中CAP涂層呈納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在15倍SBF中呈片層狀結(jié)構(gòu)。4采用擠壓法成功地改善顆粒造孔工藝制備的多孔HA陶瓷支架的貫通性，實(shí)現(xiàn)了完全網(wǎng)化的多孔貫通結(jié)構(gòu)；造孔劑的顆粒大小基本不影響支架的孔隙率；支架的收縮率與造孔劑蠟球大小和成形劑甲殼素?zé)o關(guān)；影響支架收縮率的主要因素是HA的濃度，HA的濃度越高，支架的收縮率越小，但過(guò)高的HA濃度不利于支架的收縮；造孔劑粒度對(duì)支架的抗壓強(qiáng)度有明顯影響隨著蠟球粒度的增大，對(duì)應(yīng)的網(wǎng)化HA陶瓷支架的抗壓強(qiáng)度逐漸降低。

簡(jiǎn)介：目的膝骨性關(guān)節(jié)炎OSTEOARTHRISIS，OA又稱(chēng)為膝關(guān)節(jié)增生性關(guān)節(jié)炎、退行性關(guān)節(jié)炎、肥大性關(guān)節(jié)炎等，是一種常見(jiàn)的、好發(fā)于中老年人的疾病。膝關(guān)節(jié)是一個(gè)三間室關(guān)節(jié)，其中髕股關(guān)節(jié)PATELLOFEMALJOINT是其重要組成部分。目前，通過(guò)關(guān)節(jié)鏡行膝關(guān)節(jié)清理術(shù)治療膝骨性關(guān)節(jié)炎被臨床廣泛采用，具體的手術(shù)方法包括炎性增生滑膜的清除、半月板的修整、關(guān)節(jié)腔炎性滲液的沖洗、軟骨碎屑及游離體清除、關(guān)節(jié)腔內(nèi)增生骨贅清除等，根據(jù)膝關(guān)節(jié)病變程度的不同及臨床醫(yī)師認(rèn)識(shí)上的不同，臨床上膝關(guān)節(jié)清理術(shù)所包含的內(nèi)容不盡相同，目前沒(méi)有形成一個(gè)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，其療效也差異較大。本課題主要通過(guò)關(guān)節(jié)鏡下膝關(guān)節(jié)清理術(shù)包括髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓與關(guān)節(jié)鏡下膝關(guān)節(jié)清理術(shù)不包括髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓療效的對(duì)比，來(lái)探討關(guān)節(jié)鏡下髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓即對(duì)髕股關(guān)節(jié)的處理治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的療效。方法隨機(jī)抽取2002年2006年于我科住院并采用關(guān)節(jié)鏡下膝關(guān)節(jié)清理治療膝骨性關(guān)節(jié)炎病例60例，隨機(jī)分為兩組，每組30例病人。其中一組采用膝關(guān)節(jié)清理術(shù)不包括髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓治療膝骨性關(guān)節(jié)，為對(duì)照組；另一組采用關(guān)節(jié)鏡下膝關(guān)節(jié)清理術(shù)包括髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓治療膝骨性關(guān)節(jié)，為試驗(yàn)組。采用HSS評(píng)分美國(guó)特種外科醫(yī)院評(píng)分系統(tǒng)來(lái)評(píng)價(jià)患者膝關(guān)節(jié)，髕骨推移試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)髕骨活動(dòng)度。收集兩組術(shù)前及術(shù)后3個(gè)月時(shí)HSS評(píng)分及髕骨推移試驗(yàn)結(jié)果，試驗(yàn)組與對(duì)照組組內(nèi)術(shù)前術(shù)后HSS評(píng)分的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用配對(duì)T檢驗(yàn)；試驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)前HSS評(píng)分的優(yōu)良率的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用卡方檢驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后HSS評(píng)分的優(yōu)良率的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用卡方檢驗(yàn)；將HSS評(píng)分中疼痛及功能行走功能兩個(gè)分項(xiàng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)對(duì)比試驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后疼痛評(píng)分的差值即增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)與對(duì)照組術(shù)前、術(shù)后疼痛評(píng)分的差值即增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)采用兩樣本均數(shù)比較的T檢驗(yàn)進(jìn)行比較，同理，試驗(yàn)組術(shù)前、術(shù)后功能評(píng)分的差值即增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)與對(duì)照組術(shù)前、術(shù)后功能評(píng)分的差值即增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)采用兩樣本均數(shù)比較的T檢驗(yàn)進(jìn)行比較；試驗(yàn)組與對(duì)照組組內(nèi)髕骨推移試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)采用構(gòu)成比來(lái)比較。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS100軟件包做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，均以P005，統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異性，兩組術(shù)后優(yōu)良率之間存在可比性；試驗(yàn)組與對(duì)照組術(shù)后HSS評(píng)分的優(yōu)良率的比較P50000，試驗(yàn)組疼痛評(píng)分的增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組。22試驗(yàn)組與對(duì)照組功能評(píng)分差值的比較P23667，試驗(yàn)組功能評(píng)分的增長(zhǎng)分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組。3試驗(yàn)組與對(duì)照組髕骨活動(dòng)度改善的比較31試驗(yàn)組髕骨推移試驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成比比較術(shù)前01區(qū)為833％，術(shù)前2區(qū)為167％；術(shù)后01區(qū)為167％，術(shù)后2區(qū)為833％。試驗(yàn)組術(shù)前術(shù)后構(gòu)成比變化較大。32對(duì)照組髕骨推移試驗(yàn)結(jié)果構(gòu)成比比較術(shù)前01區(qū)為800％，術(shù)前2區(qū)為200％；術(shù)后01區(qū)為800％，術(shù)后2區(qū)為200％。對(duì)照組術(shù)前術(shù)后構(gòu)成比無(wú)明顯變化。結(jié)論1采用膝關(guān)節(jié)鏡下髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓手術(shù)方法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎，在近期的臨床觀察中在三個(gè)月這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，有明確的療效，能夠改善病人患側(cè)膝關(guān)節(jié)的整體功能，其中，可以明顯緩解膝關(guān)節(jié)的疼痛癥狀，改善膝關(guān)節(jié)的行走功能，值得臨床推廣。2采用膝關(guān)節(jié)鏡下髕股關(guān)節(jié)應(yīng)力區(qū)減壓手術(shù)方法治療膝骨性關(guān)節(jié)炎，在近期的臨床觀察中在三個(gè)月這個(gè)時(shí)間點(diǎn)上，可以改善髕骨活動(dòng)，有利于恢復(fù)髕股骨正常的對(duì)合關(guān)系。

簡(jiǎn)介：本文分三個(gè)章節(jié)進(jìn)行探討第一章載體的構(gòu)建、細(xì)胞的分離培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染目的構(gòu)建過(guò)氧化物酶增殖物活化受體Γ（PEROXISOMEPMLIFEMTACTIVATEDRECEPTΓ，PPARΓ）基因的發(fā)夾狀干擾RNA（SHRNA）并攜帶鹽酸強(qiáng)力霉素（DOXYCYCLINEHYCLATE，DOX）正向調(diào)控“TETON”系統(tǒng)的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)染大鼠BMSC，觀察并比較不同濃度四環(huán)素誘導(dǎo)后BMSC中PPAR?；虺聊闆r，成骨及成脂分化情況。方法利用RNAI技術(shù)，以小鼠PPAR?；?yàn)榘谢?，?gòu)建靶向小鼠PPAR?；虻摹癟ETON”慢病毒載體，除了攜帶目的基因PPARΓSHRNA外，還將攜帶四環(huán)素正向調(diào)控的“TETON”系統(tǒng)和紅色熒光蛋白（RFP）基因標(biāo)記。通過(guò)將測(cè)序正確的慢病毒載體包裝并測(cè)定滴度后，轉(zhuǎn)染大鼠BMSC，觀察紅色熒光蛋白的表達(dá)變化情況。RTPCR（REALTIMEQUANTITATIVEPCR）檢測(cè)PPARΓMRNA、成脂因子ADD1MRNA和成骨因子COLLAGENIMRNA的表達(dá)水平，WESTERNBLOT檢測(cè)PPARΓ蛋白、ADD1蛋白和Ⅰ型膠原蛋白（COLLAGENⅠ）的表達(dá)，從而確定轉(zhuǎn)染后PPAR?；虻某聊?yīng)。分別將轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（TRANSFECTEDMESENCHYMALSTEMCELLSTBMSC）向成骨誘導(dǎo)，通過(guò)轉(zhuǎn)染前后堿性磷酸酶（ALP）定性檢測(cè)成骨分化能力；向成脂分化方向誘導(dǎo)，通過(guò)轉(zhuǎn)染前后油紅O染色對(duì)比成脂能力。結(jié)果設(shè)計(jì)并篩選出SHRNA序列GTCTGCTGATCTGCGAGCC。成功構(gòu)建了PPARΓ基因的“TETON”慢病毒載體，測(cè)量滴度為3610E8TUML，轉(zhuǎn)染大鼠BMSC后，與未轉(zhuǎn)染BMSC比較，PPARΓMRNA24H（HOURS）抑制率為36％（P結(jié)論慢病毒轉(zhuǎn)染大鼠BMSC轉(zhuǎn)染效率高，轉(zhuǎn)染的BMSC增殖能力強(qiáng)，成脂分化減弱，成骨分化增強(qiáng)，傳代后PPARΓ沉默效應(yīng)穩(wěn)定。DOX對(duì)目的基因表達(dá)調(diào)控存在濃度依賴(lài)關(guān)系，在8ΜGML時(shí)DOX調(diào)控作用最強(qiáng)。第二章HAPLLA涂層BCP支架材料制備、DOX微球的制備與支架復(fù)合目的采用將DOX包裹于微球中，再沉積于生物活性雙相磷酸鈣（BIPHASICCALCIUMPHOSPHATE，BCP）支架上，組成組織工程“BCPDOX”緩釋系統(tǒng)。方法采用的是有機(jī)泡沫浸漬法制備圓盤(pán)狀2MM5MM（直徑R5MM）BCP多孔支架，用羥基磷灰石左旋聚乳酸（HAPLLA）涂層兩遍。通過(guò)雙乳液法制備聚乙丙交酯聚乙二醇（PLGAMPEGLAGA91）共聚物載DOX微球，將制備出的載藥微球涂層BCP多孔支架上，傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和掃描電鏡（SEM）對(duì)支架材料的表面結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行分析，并進(jìn)行體外PBS溶液中的釋藥實(shí)驗(yàn)。結(jié)果制備的的載DOX微球載藥量為05％，包封率為247％；電鏡顯示微球尺寸在15～20ΜM，大小分布均勻，在孔徑300～600ΜM的多孔HAPLLA涂層BCP支架上容易粘附。體外PBS緩沖液中釋放顯示，前16H內(nèi)有爆釋現(xiàn)象，其中8H釋放月326％，7D釋放655％，7D后進(jìn)入緩慢釋放階段，可控制釋放約60D。結(jié)論BCP支架孔徑為300～600ΜM、孔隙率908％～923％、力學(xué)性能48～573MPA，可以滿(mǎn)足松質(zhì)骨壓縮強(qiáng)度的要求。載DOX微球大小均勻，可以良好地附著B(niǎo)CP多孔支架上，有良好緩釋作用。第三章復(fù)合TBMSC的多孔BCPDOX支架治療大鼠骨缺損的研究目的將“BCPDOX”支架緩釋系統(tǒng)，復(fù)合轉(zhuǎn)染的大鼠TBMSC后，植入骨缺損處。通過(guò)DOX緩慢持續(xù)釋放，調(diào)控TBMSC在骨缺損處向成骨方向分化，作為骨修復(fù)材料治療大鼠骨骨缺損，探討骨缺損的靶向基因治療新的方法和策略。方法體外實(shí)驗(yàn)利用BMSC和TBMSC對(duì)BCPDOX支架在6H和24H時(shí)的粘附，細(xì)胞計(jì)數(shù)后驗(yàn)證支架的粘附性；通過(guò)1、3、5D的MTT實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證BCPDOX支架對(duì)細(xì)胞增殖的影響；通過(guò)誘導(dǎo)9D時(shí)的ALP染色和11D時(shí)茜素紅染色驗(yàn)證BCPDOX支架對(duì)BMSC和TBMSC的成骨分化的影響；14D后油紅O染色驗(yàn)證支架材料對(duì)BMSC和TBMSC成脂分化的影響。體內(nèi)驗(yàn)證BCPDOX支架的急性毒性實(shí)驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)。實(shí)施異位成骨實(shí)驗(yàn)，采用SD大鼠30只，制作右大腿后內(nèi)側(cè)肌袋，植入一片BCPDOX支架材料，分別在1D、1W、2W、3W和4W分批處死各6只取材并進(jìn)行HE染色，觀察免疫反應(yīng)和異位成骨情況。SD大鼠45只，制作大鼠顱骨右后囟5MM圓形骨缺損模型，隨機(jī)分為A組9只、B組18和C組18只，A組為空白對(duì)照；B植入P4代BMSCBCPDOX；C組植入P4代TBMSCBCPDOX。在4、8和12W分批處死，X線和MICROCT分析支架的成骨量。結(jié)果在BCPDOX支架的影響下，6H和24H后TBMSC組比BMSC組粘附率低，兩組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005），24H后粘附率均在70％以上。增殖率在1D和3D各組無(wú)明顯區(qū)別；5D后，TBMSCBCPDOX組和BMSCBCPDOX組增殖率低于BMSC組，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P005）。5D后電鏡掃描顯示BCPDOX支架細(xì)胞周?chē)屑?xì)胞外基質(zhì)及載DOX的PLGAMPEG微球。三組細(xì)胞的ALP定量分析，6D和9D時(shí)，BMSCBCPDOX組較BMSC組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（PBMSCBCPDOX組BMSC組。油紅O染色分析，誘導(dǎo)14D后，TBMSCBCPDOX組較BMSCBCPDOX組和BMSC組明顯減少，有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P結(jié)論BCPDOX支架有良好的生物相容性，TBMSC在支架上具有良好的粘附、增殖和成骨分化能力。多孔BCPDOX支架復(fù)合TBMSC具有良好的骨缺損修復(fù)能力。

簡(jiǎn)介：目的對(duì)跟骨骨折SERS分型Ⅲ型的患者行切開(kāi)復(fù)位AO跟骨板內(nèi)固定植骨術(shù)，觀察臨床療效，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)并提高治療效果，盡量降低并發(fā)癥的發(fā)生率，提高患者功能恢復(fù)的效果，為臨床治療方案的選擇提供參考。方法本次研究共收錄25例SERSⅢ型跟骨骨折，均來(lái)自江蘇省中醫(yī)院骨傷科病房，將其分為三組A組患者共8例，術(shù)中植骨材料為自體髂骨；B組患者共9例，術(shù)中植骨材料為同種異體骨；C組患者共8例，未予植骨治療。術(shù)后靜滴抗生素及口服中藥支持治療，通過(guò)對(duì)患者術(shù)后足部功能恢復(fù)、術(shù)后并發(fā)癥、跟骨X線形態(tài)等進(jìn)行隨訪，隨訪1217個(gè)月，平均隨訪14個(gè)月，所得數(shù)據(jù)使用SPSS190統(tǒng)計(jì)軟件，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理分析，以推斷不同治療方案的療效是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果所有患者術(shù)后切口均一期愈合，未出現(xiàn)切口處皮膚壞死等并發(fā)癥。1、術(shù)后三組MARYL評(píng)分術(shù)后功能評(píng)分上植骨組A、B與未植骨組C存在明顯差異（P＜005）；A組、B組兩組相比較無(wú)明顯差異P＞005。2、骨折復(fù)位丟失率植骨組A、B與未植骨組C存在明顯差異P＜005；A組、B組兩組相比較無(wú)明顯差異P＞005。3、術(shù)后及隨訪期間三組間X線指標(biāo)情況①術(shù)后BOLHER角、GISSANE角、跟骨寬度、跟骨高度三組比較無(wú)明顯差異P＞005；②術(shù)后6個(gè)月時(shí)植骨組A、B與未植骨組C在BOLHER角及跟骨高度上有明顯差異（P＜005），在GISSANE角與跟骨寬度上沒(méi)有明顯差異P＞005，A組、B組兩組各項(xiàng)指標(biāo)相比較均無(wú)明顯差異P＜005；③術(shù)后一年植骨組A、B與未植骨組C在BOLHER角及跟骨高度上有明顯差異（P＜005），在GISSANE角與跟骨寬度上沒(méi)有明顯差P＞005，A組、B組兩組各項(xiàng)指標(biāo)相比較均無(wú)明顯差異P＞005。4、術(shù)后及隨訪期間各組內(nèi)各X線指標(biāo)變化情況①高度術(shù)后及隨訪期間A組、B組跟骨高度均無(wú)明顯變化P＞005，C組術(shù)后與術(shù)后6個(gè)月相比較無(wú)明顯變化P＞005，術(shù)后6個(gè)月、術(shù)后一年相比較存在明顯差異（P＜005）；②寬度術(shù)后及隨訪期間三組跟骨寬度均無(wú)明顯的變化P＞005；③BOLHER角術(shù)后及隨訪期間A組、B組兩組相比較無(wú)明顯差異P＞005；C組術(shù)后、術(shù)后6個(gè)月相比較無(wú)明顯變化P＞005，術(shù)后6個(gè)月、術(shù)后一年相比較存在明顯差異（P＜005）；④GISSANE角術(shù)后及隨訪期間三組GISSANE角均無(wú)顯著變化P＞005。結(jié)論1、切開(kāi)復(fù)位AO鋼板內(nèi)固定植骨治療跟骨SERSⅢ骨折，能明顯改善患者術(shù)后跟骨高度及BOLHER角的恢復(fù)，對(duì)跟骨寬度、GISSANE角的改變無(wú)明顯作用。2、切開(kāi)復(fù)位AO鋼板內(nèi)固定術(shù)治療跟骨SERSⅢ骨折術(shù)中植骨可以明顯地提高療效，對(duì)改善患者負(fù)重后跟骨高度和BOLHER角的復(fù)位丟失情況有顯著效果。3、同種異體骨植骨術(shù)風(fēng)險(xiǎn)可控，手術(shù)創(chuàng)傷小，病人所受痛苦少，在臨床上值得推廣。

簡(jiǎn)介：中國(guó)圖書(shū)資料分類(lèi)法單位代碼10660分類(lèi)號(hào)R7822學(xué)號(hào)S100347貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院20132013屆碩士學(xué)位論文屆碩士學(xué)位論文PTHPTH調(diào)控下頜骨牽張成骨中調(diào)控下頜骨牽張成骨中OPGOPG、RANKLRANKL及骨形成標(biāo)志物的表達(dá)形成標(biāo)志物的表達(dá)研究研究研究生朱鵬娜導(dǎo)師唐正龍年級(jí)2010級(jí)專(zhuān)業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)2013年05月25日基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)81160130貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院2013屆碩士研究生論文2PTH調(diào)控下頜骨牽張成骨中OPG、RANKL及骨形成標(biāo)志物的表達(dá)研究專(zhuān)業(yè)口腔臨床醫(yī)學(xué)研究生朱鵬娜導(dǎo)師唐正龍教授中文摘要中文摘要【摘要【摘要】目的目的探索不同劑量重組人甲狀旁腺素（RECOMBINANTHUMANPARATHYROIDHMONE，RHPTH）調(diào)控兔下頜骨牽引延長(zhǎng)中骨保護(hù)素（OSTEOPROTEGERIN，OPG）、核因子ΚB受體活化因子配體（RECEPTACTIVATOFNFΚBLIG，RANKL）及骨形成標(biāo)志物的表達(dá)，初步探討RHPTH促進(jìn)牽張成骨DISTRACTIONOSTEOGENESIS，DO的作用機(jī)制。對(duì)象與方法對(duì)象與方法制備兔下頜骨牽張成骨模型隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組皮下間歇注射不同劑量的RHPTH（184）A組為10ΜG日，B組為20ΜG日，C組為30ΜG日，D組為40ΜG日；對(duì)照組皮下間歇注射生理鹽水。采用免疫組化法研究OPG、RANKL及骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BONEMPHOGEICPROTEIN2BMP2在下頜骨牽張成骨新骨中的表達(dá)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)研究血清中OPG、骨特異性堿性磷酸酶BONESPECIFICALKALINEPHOSPHATASEBAP、骨鈣素OSTEOCALCINOT、Ⅰ型前膠原氨基端前肽PROCOLLAGENTYPEINTERMINALPROPEPTIDEPINP的水平。結(jié)果結(jié)果1、免疫組化結(jié)果顯示隨固定期的延長(zhǎng)，OPG的陽(yáng)性表達(dá)逐漸下降。在固定0周時(shí)，B、C、D組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；固定1周時(shí)，C、D組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；固定2周時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨固定期的延長(zhǎng)，RANKL的陽(yáng)性表達(dá)逐漸上升。在固定0周時(shí)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；固定1周時(shí)，B、C、D組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；固定2周時(shí)，C、D組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。BMP2的陽(yáng)性表達(dá)趨勢(shì)同OPG。

簡(jiǎn)介：目的觀察芍藥甘草湯對(duì)膽囊切除術(shù)后膽道型ODDI括約肌功能障礙的臨床療效。方法參考羅馬Ⅲ（膽囊及ODDI括約肌功能障礙）及膽道型ODDI括約肌功能障礙SPHINCTEROFODDIDYSFUNCTION，SOD診斷標(biāo)準(zhǔn)，回顧性分析我院2009年6月2011年8月期間收治的符合標(biāo)準(zhǔn)的56例膽囊切除術(shù)后診斷為膽道型SOD的患者資料。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)采用隨機(jī)分組對(duì)照方法，分成治療組與對(duì)照組。治療組30人（其中膽道Ⅰ型4例，Ⅱ型8例，Ⅲ例18例），男性10例，女性20例，年齡3585歲，平均620±230歲初次發(fā)病時(shí)間為術(shù)后1657個(gè)月，平均204±53個(gè)月對(duì)照組26例（其中膽道Ⅰ型2例，Ⅱ型8例，Ⅲ型16例），男性8例，女性18例，年齡3078歲，平均397±151歲初次發(fā)病時(shí)間為術(shù)后1165個(gè)月，平均134±26個(gè)月兩組均行抗感染、糾正電解質(zhì)紊亂、調(diào)節(jié)飲食治療，治療過(guò)程始末均未給予解痙類(lèi)藥物。治療組口服芍藥甘草湯，對(duì)照組口服安慰劑（冰紅茶）。以疼痛減輕、肝功能及膽總管內(nèi)徑減小為觀察指標(biāo)，觀察中藥芍藥甘草湯的治療效果，并在1年時(shí)間內(nèi)對(duì)患者進(jìn)行后期隨訪，對(duì)其療效做出評(píng)價(jià)。結(jié)果治療組中有效25例（Ⅰ型2例，Ⅱ型有效6例，Ⅲ型有效17例），總有效率833％，1年后復(fù)發(fā)4例（Ⅰ型1例，Ⅱ型2例，Ⅲ型1例）復(fù)發(fā)率16％對(duì)照組中有效4例（Ⅰ型0例，Ⅱ型有效1例，Ⅲ型有效3例），有效率154％，1年后復(fù)發(fā)4例（Ⅱ型1例，Ⅲ型3例）復(fù)發(fā)率100％。芍藥甘草湯對(duì)減輕疼痛、改善肝功能及減小膽總管內(nèi)徑方面效果顯著且無(wú)明顯副作用。結(jié)論口服中藥芍藥甘草湯對(duì)膽囊切除術(shù)后膽道型SOD效果顯著，具有療程短、見(jiàn)效快、改善肝功能、減小膽總管擴(kuò)張程度、副作用小，復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點(diǎn)。膽道各型SOD的療效差異，需經(jīng)大樣本進(jìn)一步觀察。中藥治療無(wú)效患者EST治療是其首選方案，對(duì)于EST禁忌、無(wú)條件施行及治療困難者可考慮手術(shù)治療。

簡(jiǎn)介：目的探討吡格列酮PIOGLITAZONE對(duì)核因子NFΚB受體激活劑配體RECEPTACTIVATOFNFΚBLIG，RANKL聯(lián)合巨噬細(xì)胞集落刺激因子MACROPHAGECOLONYSTIMULATINGFACT，MCSF誘導(dǎo)的人破骨樣細(xì)胞OSTEOCLASTLIKECELLS，OLCS基質(zhì)金屬蛋白酶9MATRIXMETALLOPROTEINASE9，MMP9MRNA表達(dá)的影響。方法從人外周血以密度梯度離心法分離出單個(gè)核細(xì)胞貼壁培養(yǎng)，之后以RANKL50NGML聯(lián)合MCSF25NGML進(jìn)行誘導(dǎo)。14天后使用抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色法以及掃描電鏡觀察骨片以鑒定細(xì)胞是否具有破骨細(xì)胞的特征。誘導(dǎo)成功后再使用不同濃度的吡格列酮0，105，106，107MOLL繼續(xù)干預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)，之后收集各組細(xì)胞，使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RTPCR的方法檢測(cè)各組MMP9MRNA的表達(dá)變化。結(jié)果1RANKL聯(lián)合MCSF誘導(dǎo)生成的細(xì)胞形態(tài)具備破骨細(xì)胞的特征，抗酒石酸酸性磷酸酶TRAP染色陽(yáng)性具有在骨片上形成骨吸收陷窩的能力。2RTPCR檢測(cè)結(jié)果顯示人破骨樣細(xì)胞能夠表達(dá)MMP9MRNA。3在各濃度吡格列酮105，106，107MOLL干預(yù)培養(yǎng)48小時(shí)后，MMP9MRNA表達(dá)均較空白對(duì)照組顯著下降P結(jié)論RANKL聯(lián)合MCSF誘導(dǎo)可以從人外周血中誘導(dǎo)出破骨樣細(xì)胞。誘導(dǎo)所得的人破骨樣細(xì)胞能夠表達(dá)MMP9MRNA。吡格列酮可以抑制人破骨樣細(xì)胞MMP9MRNA的表達(dá)，且存在濃度依賴(lài)性。

簡(jiǎn)介：骨質(zhì)疏松癥OSTEOPOSISOP是一種以骨量低下、骨微結(jié)構(gòu)破壞、導(dǎo)致骨脆性增加、易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。隨人類(lèi)壽命的延長(zhǎng)和社會(huì)老年化的到來(lái)，骨質(zhì)疏松癥已成為人類(lèi)重要的健康問(wèn)題。目前對(duì)骨質(zhì)疏松的治療措施主要分為基礎(chǔ)措施和藥物治療兩個(gè)方面?；A(chǔ)治療措施中主要是補(bǔ)充鈣劑和維生素D。藥物治療主要包括抗骨吸收藥物、促骨形成藥物和其他藥物。但由于對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制并不完全清楚，所以當(dāng)前對(duì)于骨質(zhì)疏松的治療并不理想。因此，進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松形成機(jī)制以及尋求更好的治療方法，降低骨折發(fā)病率和提高生活質(zhì)量是當(dāng)前骨質(zhì)疏松治療研究的重點(diǎn)。骨質(zhì)疏松發(fā)病機(jī)制有很多，目前也取得了很多進(jìn)展。近年來(lái)有越來(lái)越多的證據(jù)證明骨質(zhì)疏松與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的相對(duì)缺乏相關(guān)；而且大量的研究發(fā)現(xiàn)患有骨質(zhì)疏松的絕經(jīng)期女性與正常女性相比不但常常伴有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的降低，同時(shí)伴有骨髓組織中脂肪成分的增加。那么也就是說(shuō)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化能力的增加也可能是骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制。是不是抑制了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂分化就能在一定程度上緩解骨質(zhì)疏松的進(jìn)程。要抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪分化，我們首先要明確骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的關(guān)健調(diào)控因素。國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)異位病毒整合位點(diǎn)1（ECTOPICVIRALINTEGRATIONSITE，EVI1）是前脂肪細(xì)胞3T3L1分化為成熟脂肪細(xì)胞的決定因素；干擾該基因的表達(dá)則會(huì)阻斷3T3L1細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化的進(jìn)程。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分成為脂肪細(xì)胞，也可視為一種前脂肪細(xì)胞，異位病毒整合位點(diǎn)也應(yīng)該會(huì)決定其向脂肪細(xì)胞分化的過(guò)程?；谝陨?，提出三點(diǎn)假設(shè)在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化過(guò)程中存在EVI1基因的表達(dá)；EVI1基因決定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪分化；抑制EVI1基因的表達(dá)可以促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對(duì)以上問(wèn)題展開(kāi)了研究工作，研究?jī)?nèi)容主要包括以下四個(gè)部分1、提取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。2、在干細(xì)胞成脂分化過(guò)程中研究EVI1基因的表達(dá)以及如何表達(dá)。3、構(gòu)建腺病毒載體，采用RNA干擾技術(shù)轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并測(cè)定其干擾效率和干擾作用。4、制作大鼠骨質(zhì)疏松模型，通過(guò)尾靜脈注射腺病毒轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，觀察對(duì)骨質(zhì)疏松的治療效果。第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定目的學(xué)習(xí)并掌握大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)技術(shù)，并進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞表面標(biāo)記物、成骨成脂誘導(dǎo)分化的鑒定。為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)。方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性SPF級(jí)SPRAGUEDAWLEY（SD）大鼠，體重100120G由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。2大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BONEMESENCHYMALSTEMCELLS，BMSCS）的原代分離培養(yǎng)5％水合氯醛腹腔注射麻醉SD大鼠，無(wú)菌條件下快速取大鼠的股骨及脛骨，去除肌肉等軟組織，PBS清洗干凈。剪掉長(zhǎng)骨的骨骺端，露出骨髓腔，用含有100UML青、鏈霉素和10?S的LDMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，直至骨質(zhì)發(fā)白；將沖出的骨髓內(nèi)容物分置于培養(yǎng)瓶中，每只動(dòng)物骨髓可接種兩個(gè)T25培養(yǎng)瓶，置于37℃、5CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。3BMSCS的培養(yǎng)、純化及傳代在原代培養(yǎng)過(guò)程中，24小時(shí)后更換全部培養(yǎng)基，以后每周更換兩次完全培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)皿約90時(shí)，使用胰酶EDTA溶液消化，145的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。4BMSCS的形態(tài)學(xué)檢查培養(yǎng)后使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化以及生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行拍照。5流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定的細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好BMSCS，胰酶EDTA溶液消化，1000轉(zhuǎn)分鐘離心5分鐘，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞，依次在各管中加入單克隆抗體CD34CD44CD45和CD904℃條件下孵育30分鐘，用PBS液洗滌細(xì)胞3次，以除去未結(jié)合抗體，與FITC標(biāo)記和PE標(biāo)記的二抗避光作用30分鐘，再用PBS液重懸細(xì)胞并置于冰上，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。6BMSCS的成骨成脂誘導(dǎo)分化能力取第3代生長(zhǎng)良好的BMSCS，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至細(xì)胞密度達(dá)8090時(shí)，在各誘導(dǎo)孔的完全培養(yǎng)液中分別加入成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑，各誘導(dǎo)孔每34天換液1次，同時(shí)設(shè)置LDMEM完全培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)孔作為空白對(duì)照。成骨細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)16天后，室溫下4多聚甲醛固定10分鐘，對(duì)誘導(dǎo)分化的成骨細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色；成骨誘導(dǎo)時(shí)細(xì)胞密度要求達(dá)到100，成脂細(xì)胞誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)21天后，4多聚甲醛固定，對(duì)誘導(dǎo)分化的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色。倒置顯微鏡下觀察并拍照。結(jié)果1BMSCS的形態(tài)學(xué)觀測(cè)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)主要呈梭形細(xì)胞，細(xì)胞集落呈放射狀排列，細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，可穩(wěn)定傳代20代以上。2BMSCS表面標(biāo)記物的表達(dá)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CD44、CD90均呈陽(yáng)性表達(dá)，而CD34、CD45呈陰性表達(dá)。3BMSCS成骨成脂誘導(dǎo)分化鑒定經(jīng)成骨、成脂誘導(dǎo)分化后，分別用茜素紅染色和油紅O染色均呈陽(yáng)性。結(jié)論全骨髓貼壁培養(yǎng)法操作步驟簡(jiǎn)單，能夠大量分離、純化、擴(kuò)增骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的細(xì)胞具有骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性，經(jīng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后有成骨和成脂分化潛能。第二部分EVI1基因在骨髓干細(xì)胞成脂分化中的表達(dá)目的在體外通過(guò)成熟的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)其成脂分化，使用PCR和WESTERNBLOTTING方法檢測(cè)EVI1基因的表達(dá)。方法1細(xì)胞傳至第3代全骨髓貼壁培養(yǎng)法提取的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2引物設(shè)計(jì)與合成引物設(shè)計(jì)與合成由大連寶生物公司協(xié)助完成。3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外成脂誘導(dǎo)分化細(xì)胞接種于60MM培養(yǎng)皿中48小時(shí)，然后加入含200ΜM吲哚美辛，1ΜM地塞米松，05MMIBMX和05ΜGML胰島素的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每周更換兩次培養(yǎng)基。正常骨髓干細(xì)胞為對(duì)照組。4REALTIMEPCR測(cè)定EVI1基因的表達(dá)在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總RNA，按照說(shuō)明書(shū)將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成CDNA加入到1ΜLCDNA與上游引物、下游引物、水及SYBRPREMIXEXTAQ在CFX96REALTIMEPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄CT值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2ΔΔCT法）。5WESTERNBLOTTING測(cè)定EVI1基因的蛋白含量在加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基后連續(xù)10天中每日提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。配制10SDSPAGE凝膠，上樣（上樣量均為25ΜG孔）、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過(guò)一抗、二抗反反應(yīng)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用IMAGEJ軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參ΒACTIN的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果與正常培養(yǎng)的骨髓干細(xì)胞相比，EVI1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化前五天存在一過(guò)性高表達(dá)，并在第三天達(dá)到高峰。結(jié)論通過(guò)成熟的骨髓干細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)方法成功誘導(dǎo)干細(xì)胞的成脂分化，并在這一過(guò)程中運(yùn)用REALTIMEPCR和WESTERNBLOTTING分別從EVI1基因MRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證了本本實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)假設(shè)。為下一步實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行奠定了基礎(chǔ)。第三部分腺病毒載體構(gòu)建以及EVI1基因在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分中的作用目的以腺病毒為載體，體外構(gòu)建EVI1基因的干擾質(zhì)粒，對(duì)骨髓干細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染并檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率和轉(zhuǎn)染后對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂、成骨分化的影響。為基因治療骨質(zhì)疏松探索新的藥物靶點(diǎn)。方法1干擾序列的設(shè)計(jì)與合成大鼠EVI1的MRNA序列（GENEACCESSIONNONM_0011064231），分別針對(duì)第149和1423位點(diǎn)為起點(diǎn)人工合成2條SIRNA序列，綠色熒光蛋白序列作為陰性對(duì)照。2重組腺病毒的構(gòu)建與包裝選擇限制性?xún)?nèi)切酶（BGL2和HINDIII）將上述目的片斷定向克隆入穿梭載體PADTRACKU6；挑取較小的克隆，接種到含卡那霉素的5MLLB液體培養(yǎng)基中，250轉(zhuǎn)分鐘，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒；提取的穿梭質(zhì)粒用PMEI對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行線性化，通常酶切過(guò)夜；電轉(zhuǎn)化重組，取線性化的穿梭載體與腺病毒骨架載體充分混合，然后加入到電轉(zhuǎn)杯中，放入電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)化；挑取較小的單克隆，10到15個(gè)，接種到含卡那霉素的5ML液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過(guò)夜；提取質(zhì)粒，選取3到4個(gè)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，用PACI進(jìn)行酶切，然后電泳檢測(cè)篩選陽(yáng)性質(zhì)粒；將鑒定正確的質(zhì)粒按照LIPOFECTMINE2000轉(zhuǎn)染試劑要求，轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，收集細(xì)胞及培養(yǎng)液反復(fù)凍融后2000G離心收集上清；再次感染293A細(xì)胞，重復(fù)這一過(guò)程以增加病毒滴度；濃縮、純化重組腺病毒；透析純化病毒懸液；測(cè)定重組腺病毒的滴度。3轉(zhuǎn)染BMSCS取生長(zhǎng)良好的傳至第3代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞接種于60MM培養(yǎng)皿中等細(xì)胞生長(zhǎng)至80％融合時(shí)，更換無(wú)血清LDMEM培養(yǎng)基后12小時(shí)加入適量的病毒，68小時(shí)后更換為骨髓間充干質(zhì)細(xì)胞成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，24小時(shí)后在倒置熒光顯微鏡下觀察到大量綠色熒光。4通過(guò)REALTIMEPCR測(cè)定干擾效率在成功轉(zhuǎn)染后3天提取RNA，同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組，按照說(shuō)明書(shū)將提取的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成CDNA，在REALTIMEPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄CT值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2ΔΔCT）。5REALTIMEPCR測(cè)定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細(xì)胞的RNA，同時(shí)提取正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的RNA作為對(duì)照組，按照說(shuō)明書(shū)將各組的RNA在一定的化學(xué)反應(yīng)體系以及反轉(zhuǎn)錄條件下合成CDNA后，在REALTIMEPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，記錄CT值、擴(kuò)增曲線以及溶解曲線。并相對(duì)定量計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（2ΔΔCT）。6WESTERNBLOTTING測(cè)定RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別在成功轉(zhuǎn)染后1、3、5和7天提取各組細(xì)胞的蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度。配制10SDSPAGE凝膠，上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、經(jīng)過(guò)一抗、二抗反應(yīng)后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，利用IMAGEJ軟件進(jìn)行條帶分析。用目的蛋白的灰度值除去內(nèi)參ΒACTIN的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表樣品的目的蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果1干擾序列的設(shè)計(jì)與合成針對(duì)大鼠EVI1的MRNA序列（GENEACCESSIONNONM_0011064231），人工合成2條SIRNA序列，分別對(duì)5’GGAAGCAACATGGAAACAA3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的SIEVI11正鏈5’GATCCGGAAGCAACATGGAAACAATTCAAGAGATTGTTTCCATGTTGCTTCCTTTTTTG3’，反鏈5’AGCTCAAAAAAGGAAGCAACATGGAAACAATCTCTTGAATTGTTTCCATGTTGCTTCCG3’；和對(duì)5’GCAGTGAGGTCTGCCATAA3’位點(diǎn)進(jìn)行干擾的SIEVI12正鏈5’GATCCGCAGTGAGGTCTGCCATAATTCAAGAGATTATGGCAGACCTCACTGCTTTTTTG3’，反鏈5’AGCTCAAAAAAGCAGTGAGGTCTGCCATAATCTCTTGAATTATGGCAGACCTCACTGCG3’。2腺病毒干擾載體的構(gòu)建與作用實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了異位病毒整合位點(diǎn)的腺病毒干擾載體，而且對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞感染效率高達(dá)95，干擾效率分別達(dá)到了909和723。3RNA干擾對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化的影響分別用REALTIMEPCR和WESTERNBLOTTING對(duì)各組1、3、5和7天的成骨分化的標(biāo)志物BSP、OCN和OPN以及成脂分化的標(biāo)志物PPARΓ2和LPL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示RNA干擾后細(xì)胞成脂分化的標(biāo)志物明顯降低而細(xì)胞成骨分化的標(biāo)志物明顯升高。結(jié)論成功構(gòu)建異位病毒整合位點(diǎn)的RNA干擾的腺病毒載體；成功轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并且具有很高的干擾效率。驗(yàn)證了本實(shí)驗(yàn)的第二個(gè)假設(shè)，為下一步實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。第四部分SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞緩減大鼠骨質(zhì)疏松的作用目的建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，在大鼠造模后7天將SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過(guò)尾靜脈注謝的方法移植入骨質(zhì)疏松模型大鼠體內(nèi)，注射后28天通過(guò)比較各組的骨密度BMD、I型骨膠原N末端前肽（PINP）、I型膠原羥基未端肽（ΒCTX）、和股骨生物力學(xué)指標(biāo)的變化，初步得出RNAI骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠有效緩解骨質(zhì)疏松進(jìn)程。方法1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周健康雌性SPRAGUEDAWLEY（SD）大鼠40只，體重220250G，由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。分為四組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2建立大鼠脊髓損傷模型骨質(zhì)疏松模型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物5水合氯醛麻醉（06ML100G腹腔注射）；然后采用腰椎后側(cè)正中切口，椎旁純性分離肌肉組織，切開(kāi)腹膜，進(jìn)入腹腔。完整摘除雙側(cè)卵巢，給予傷口徹底的止血，逐層進(jìn)行縫合，假手術(shù)組手術(shù)操作同上，僅摘除卵巢周?chē)僭S脂肪組織。3尾靜脈注射SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松在骨質(zhì)疏松模型后7天，通過(guò)尾靜脈注射的方法將SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植入大鼠骨質(zhì)疏松模型體內(nèi)，對(duì)照組分別注射正常培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和LDMEM培養(yǎng)基。4SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松的檢測(cè)41、血清學(xué)測(cè)定大鼠尾靜脈注射治療后28日，取各組大鼠血液5ML離心后取血清用試劑盒對(duì)成骨標(biāo)志物和破骨標(biāo)示物進(jìn)行檢測(cè)。42、骨密度測(cè)定使用雙能光子骨密度儀測(cè)量整個(gè)股骨干的骨密度。43、生物力學(xué)測(cè)定取雙側(cè)股骨分別進(jìn)行三點(diǎn)彎試驗(yàn)試驗(yàn)。5統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（MEAN±SD）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。采用SPSS130統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。P結(jié)果1骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功本實(shí)驗(yàn)采用切除大鼠雙側(cè)卵巢這一成熟經(jīng)典造模方法，術(shù)后手術(shù)組大鼠較其它組體重增加，術(shù)后切口無(wú)感染，所有大鼠均存活。2血清學(xué)測(cè)定結(jié)果使用上?？泼羯锟萍加邢薰镜腅LISA試劑盒對(duì)大鼠骨生成指標(biāo)Ⅰ型膠原N端前肽和大鼠骨吸收指標(biāo)Β骨膠原交聯(lián)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示各組之間差異明顯，治療組優(yōu)于模型組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異；RNAI組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3骨密度測(cè)定結(jié)果使用雙能光子骨密度儀測(cè)量股骨的骨密度結(jié)果顯示兩治療組的骨密度較模型組有明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，RNAI組優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組；但均低于正常對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4生物力學(xué)結(jié)果三點(diǎn)彎試驗(yàn)結(jié)果顯示兩治療組生物力學(xué)測(cè)定值高于骨質(zhì)疏松模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論成功建立大鼠骨質(zhì)疏松模型；兩治療組中的大鼠骨質(zhì)疏松程度都一定程度上減輕，在緩解程度上SHEVI1轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組優(yōu)于單純骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組。EVI1基因有可能成為臨床治療骨質(zhì)疏松癥有效的藥物靶點(diǎn)。

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簡(jiǎn)介：浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文性早熟女童骨代謝特點(diǎn)的研究姓名蔡錫頂申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別碩士專(zhuān)業(yè)兒科學(xué)（內(nèi)分泌）指導(dǎo)教師梁黎20050501浙江大學(xué)碩士論文女童等不同發(fā)育階段及不同年齡組的骨代謝特點(diǎn)進(jìn)行了比較性觀察，探討性早熟女童骨代謝水平的變化及其與性發(fā)育的關(guān)系。并為今后GNRHA治療對(duì)性早熟女童骨代謝影響的研究積累臨床資料。研究對(duì)象2004年6月1日至2004年LO月30日在浙大醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科就診的性早熟女童符合納入標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭顱CT或MRJ檢查排除了中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變，無(wú)腎上腺、甲狀腺缺陷等疾病作為研究對(duì)象。對(duì)照組為同期在浙大醫(yī)學(xué)院附屬兒童醫(yī)院兒?？茩z查的年齡相匹配的正常健康女童。納入標(biāo)準(zhǔn)性早熟女童均在8歲前出現(xiàn)第二性征，CPP組骨齡皆提前15歲以上LHRH激發(fā)試驗(yàn)LH峰值12IU／L，LHIFSH06；PT組女童僅有乳房發(fā)育，生長(zhǎng)速率正常，骨齡不提前或提前L歲以?xún)?nèi)，LHRH激發(fā)試驗(yàn)LH峰值121I。I，H／。_J／LFSH06研究方法對(duì)納入研究的CPP女童按不同年齡分為小年齡組60～7，9歲和大年齡組8090歲進(jìn)行觀察研究。PT女童年齡均小于8歲。每位性早熟女重均攝左手骨片，按GP圖譜法評(píng)價(jià)骨齡。并留取患兒血清測(cè)定骨代謝生化指標(biāo)，包括骨堿性磷酸酶BAP、骨鈣素OC、I型膠原交聯(lián)羧基末端肽ICTP、胰島素樣生長(zhǎng)因子1IGF1。血樣在早晨730～900采集，分離血清，于30℃冰箱中保存，集中檢測(cè)。各標(biāo)本均用同一試劑盒檢測(cè)，批內(nèi)誤差4％。采用芬蘭WALLAC公司的VICTOR21420型時(shí)時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定骨堿性磷酸酶BAP、骨鈣索OC、胰島素樣生長(zhǎng)因子一1IGF1。骨堿性磷酸酶BAPELISA試劑盒由美國(guó)QUIDEL公司提供，骨鈣素OCELISA試劑盒由美國(guó)DSL公司提供，胰島素樣生長(zhǎng)因子1IGF1ELISA試劑盒由美國(guó)DSL公司提供。采用西安262廠生產(chǎn)的XH一6010Y放射免疫計(jì)數(shù)儀，用放射免疫法測(cè)定I型膠原交聯(lián)羧基末端肽ICTP。I型膠原交聯(lián)羧基末端肽ICTP2

簡(jiǎn)介：中文摘要??????英文摘要???目錄符號(hào)說(shuō)明??????刖舌材料與方法?????結(jié)果”討論結(jié)論?????附圖參考文獻(xiàn)??綜述致‘謝?????25???????????????????29攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文原創(chuàng)性聲明??????42THEAPHJCAⅡONOFT日EM匱TEL0D0F咖SMAIJ．MANAGEM匝NT0FB姍硼Ⅵ唧丑Y科口圈啞NS】VEOBJECTIVETOEXPLORETHETHE即EUTICEFFECTSOFM皿LALL敷臌嘲瞰LPC礙DCCOMPRESIVECRANIECTOMYK和融0MAANDTRA礎(chǔ)ONALLARGE岱叩幻電釉弘珂矗CI加印陀．ⅣECMNIECTOMYK缸LAD．姍INELDERLYPATIENTSWITHHYPERTENSIVECEREBRALHEMON五AGEINTHEBASALGMGLIONPARTOFTHEBRAINCOMPLICATEDCEREBRALHEMIA，F(xiàn)OR均ISINGTHE跚R西CALTMALMEUTLEVELFURTHERANDIMPMV迦PROGNOSISFORTHESEP蛐，PROVIDINGTHEDINICAL粵血LAL】∞緬THESE弘觸．METHODS62P西IENTSWITHHYPERTENSIVECEREBRAH跚∞矗BAGE，ADMITTEDTOOURHOSPITALFROMJANUARY2011TOJANUARY2012，喊RANDOMLYDIVIDEDINTOA甲口I玎蒯罌OL霉QE鋤困WITHSMALLFRONTOTEMPORYDEEOMPMSSIVEERAAIECTOMYH舶均幻M卿1ANDEONLMLGROUPTREATEDWITHTRADITIONALLARGE岔0R曲噸孤】P吖D￡C贓驢暇商YECRAAIECTOMY㈣31。THECASE蛐，IEBL∞D(zhuǎn)MGANDCOMPLICATIONANDGLASGOOUTCOMESCALECORESAFTER3MONTHSTREATMENTWEREAVLALYZEDANDCOMPAREDBETWEENTHE29ROUPS．RESULTSTHECASEFMLITYRATEⅥ憾12．9％AND19．4％INTHEEXPEFIMEUTALGROUPANDCONTROLGMUP，RESPECTIVELY，WITHOUTSIGNIFICANTDIFFERMCESP0．05；THERATEOFREBLEEDINGWAS9．7％AND12．9％INTHE2GROUTSWITHOUTSI掣JIFI,ZM固南即C如O．05．MINCIDENCEOFEOMPLIEATIONSWAS19．4％AND48．4％INTHE29ROUPSWITHSIGNIFICANTDIFFETENTXR如0．05；AFTERTREATED12WEEKS，THECOIESOFGLASGOWOUTCOMESCALEINTHEEXPERIMEMALGROUPWERESIL唧ORTOTHOSEINTHECONTROLGROUPO0．05．CONCLUSION2

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簡(jiǎn)介：目的本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察中藥復(fù)方養(yǎng)血調(diào)肝方（YXTGF）對(duì)去卵巢大鼠所致的絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（PMOP）的影響，探討中醫(yī)藥對(duì)PMOP從肝論治的新思路，并為PMOP的中醫(yī)藥臨床研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法健康未孕雌性WISTAR大鼠80只，隨機(jī)分為8組，每組10只，即青齡組、假模型組、模型組、養(yǎng)血調(diào)肝方小劑量組、養(yǎng)血調(diào)肝方中劑量組、養(yǎng)血調(diào)肝方大劑量組、六味地黃丸組、尼爾雌醇組。后六組通過(guò)切除大鼠雙側(cè)卵巢誘導(dǎo)PMOP模型。連續(xù)給藥4個(gè)月后，各組大鼠處死，測(cè)定大鼠骨密度BMD和骨礦含量BMC、血清鈣SCA和磷SP含量，檢測(cè)和分析骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)指標(biāo)；并對(duì)大鼠子宮做病理檢查。結(jié)果各組大鼠之間SP無(wú)顯著性差異。中藥組與模型組相比有升高SCA趨勢(shì)，尼爾雌醇組則有降低SCA和SP趨勢(shì)，但也都無(wú)顯著性差異（除中劑量組之外）。假模型組和各給藥組的大鼠股骨BMD和BMC均較模型組有顯著增加，青齡組的BMD和BMC低于假模型組較明顯。青齡組、假模型組和各給藥組的股骨干骺端骨小梁結(jié)構(gòu)均強(qiáng)于模型組。模型組與青齡組、假模型組相比，各靜、動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)都有明顯差異。養(yǎng)血調(diào)肝方大、中劑量組、六味地黃丸組、尼爾雌醇組與模型組相比，各靜態(tài)學(xué)參數(shù)骨小梁面積百分比（％TBAR）、骨小梁厚度（TBTH）和皮質(zhì)骨厚度（COWI）均較模型組顯著增加P＜005，P＜001，而骨小梁間隔（TBSP）小于模型組；各動(dòng)態(tài)學(xué)參數(shù)熒光雙標(biāo)記間距（DDL）、熒光雙標(biāo)記線占總骨小梁表面的百分比（SFRACTD）、骨面積水平骨形成率（BFRBS）、礦化沉積速率（MIAR）和骨小梁表面破骨細(xì)胞數(shù)目（OCN）均較模型組顯著減少P＜005，P＜001。各給藥組之間在某些參數(shù)上亦有一定程度差異。大鼠切除卵巢后，子宮明顯萎縮，內(nèi)膜變薄，腺體稀少；而養(yǎng)血調(diào)肝方、六味地黃丸及尼爾雌醇均能不同程度地減輕子宮內(nèi)膜和腺體的萎縮，且尼爾雌醇組子宮內(nèi)膜呈增生早期改變。結(jié)論本課題的研究結(jié)果表明大鼠切除卵巢后成功復(fù)制成PMOP模型；經(jīng)養(yǎng)血調(diào)肝方治療后，各觀察指標(biāo)均有顯著性改善。提示養(yǎng)血調(diào)肝方能抑制骨吸收、促進(jìn)骨量的增長(zhǎng)，改善PMOP大鼠的骨結(jié)構(gòu)，提高股骨骨密度和骨礦含量；并能改善去卵巢后子宮內(nèi)膜和腺體的萎縮狀況，但并不呈現(xiàn)增生期改變。說(shuō)明養(yǎng)血調(diào)肝方具有良好的防治PMOP作用，在BMD、BMC和骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)等指標(biāo)方面，其綜合效果有優(yōu)于六味地黃丸的趨勢(shì)，與尼爾雌醇相當(dāng)。