簡介：分類號分類號S852授予學位單位代碼授予學位單位代碼10434學號號2016120269山東農(nóng)業(yè)大學全日制碩士專業(yè)學位論文不同分子生物學方法用于檢測雞傳染性貧血病毒時的比較研究COMPARISONOFDIFFERENTMOLECULARBIOLOGICALMETHODSFDETECTIONOFCHICKENINFECTIOUSANEMIAVIRUS2018年6月8日姓名姓名張玉標張玉標學位類別學位類別獸醫(yī)碩士獸醫(yī)碩士專業(yè)專業(yè)獸醫(yī)研究方向研究方向分子病毒學分子病毒學學院學院動物科技學院動物科技學院指導教師指導教師趙鵬副教授副教授關(guān)于學位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)的聲明本人所呈交的學位論文，是在導師指導下，獨立進行科學研究所取得的成果。對在論文研究期間給予指導、幫助和做出重要貢獻的個人或集體，均在文中明確說明。本聲明的法律責任由本人承擔。本人完全了解山東農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留和使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留和按要求向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文紙質(zhì)本和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)山東農(nóng)業(yè)大學可以將本學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存論文和匯編本學位論文，同時授權(quán)中國科學技術(shù)信息研究所將本學位論文收錄到中國學位論文全文數(shù)據(jù)庫，并向社會公眾提供信息服務。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。論文作者簽名導師簽名日期

簡介：研究背景目前我國正逐漸步入老齡化社會由于高血壓、糖尿病、高脂血癥等相關(guān)疾病發(fā)病率的上升加之現(xiàn)代人們不合理的飲食結(jié)構(gòu)、不良的生活方式以及較大的精神壓力缺血性心血管疾病如冠狀動脈粥樣硬化性心臟、外周缺血性疾病的發(fā)病率逐年上升病死率、致殘率高不僅嚴重影響人們的生活質(zhì)量而且給社會和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔。如今常規(guī)藥物治療、外科和經(jīng)皮介入血管重建術(shù)的快速發(fā)展使得大部分患者能夠正常的生活工作。然而仍有一部分患者術(shù)后出現(xiàn)再狹窄、微血管功能障礙或由于彌漫性或嚴重的病變不適于常規(guī)血管成形術(shù)而藥物治療不能有效控制癥狀。因此必須再尋求其他新的治療策略。上世紀90年代以來人們發(fā)現(xiàn)組織器官缺血時機體內(nèi)促血管生成相關(guān)因子的表達反應性增加通過促進缺血組織的血管新生加速側(cè)枝循環(huán)的建立從而改善血流灌注但自身代償往往不充分、不及時而給予外源性生長因子即“治療性血管新生”為缺血性疾病治療提供了新的思路是當前國際上最熱點研究領(lǐng)域之一。最早用于治療性血管新生的有血管內(nèi)皮生長因子VULARENDOTHELIALGROWTHFACTVEGF和成纖維細胞生長因子FIBROBLASTGROWTHFACTFGF。VEGF和FGF通過了Ⅰ期臨床試驗但Ⅱ期臨床試驗的結(jié)果卻不盡如人意。VEGF不能誘導功能成熟的血管形成出現(xiàn)血管滲漏、組織水腫等不良反應；FGF治療可以促進血管新生但部分患者出現(xiàn)蛋白尿。目前有關(guān)VEGF和FGF的臨床研究已經(jīng)停止。人們逐漸意識到血管新生是一個復雜的生物學過程單純針對某階段或應用單一因子干預治療難以形成趨近生理狀態(tài)的成熟的新生血管。如何實現(xiàn)理想血管重建是血管新生領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)近年來研究顯示低氧誘導因子1HYPOXIAINDUCIBLEFACT1HIF1是一個非常重要的核轉(zhuǎn)錄因子由Α和Β兩個亞基組成Α為其功能活性亞基。HIF1Α與Β結(jié)合后從胞漿轉(zhuǎn)位到核內(nèi)直接或間接調(diào)控多種下游靶基因涉及到血管生長、血管張力、糖代謝、紅細胞生成等多種病理生理改變。到目前為止已發(fā)現(xiàn)參與血管新生的30多種基因受HIF1Α的調(diào)控因此HIF1Α是血管新生的上游核心調(diào)控因子。臨床前期研究表明HIF1Α治療誘導的新生血管具有無明顯炎癥反應、不滲漏、不引起組織水腫的特點從而形成生理功能完整的新生血管。因此HIF1Α是一個十分具有應用前景的血管新生治療因子。然而HIF1Α在常氧下的半衰期很短5MIN即可全部降解。這是由于HIF1Α含有氧依賴降解區(qū)OXYGENDEPENDENTDEGRADATIONDOMAINODDDODDD區(qū)PRO402以及PR0564兩個脯氨酸殘基是否羥基化決定其蛋白穩(wěn)定性。常氧情況下PRO402和或PRO564被脯氨酸羥化酶PPROLYLHYDROXYLASEDOMAINPHD羥化后經(jīng)泛素途徑降解。低氧時該過程受到抑制HIF1Α不被降解因而變得穩(wěn)定。氧濃度除了對HIF1Α蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié)以外更為重要的是對HIF1Α轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)。HIF1Α的C末端含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)CTRANSACTIVATIONDOMAINSCTKD常氧情況下CTAD803位點的天門冬酰胺ASN803被羥化可阻止HIF1Α與部分輔助激活因子如CBPP300的結(jié)合降低其轉(zhuǎn)錄活性。故即使蛋白穩(wěn)定的HIF轉(zhuǎn)位到核內(nèi)后因HIF1Α的CTADASN803羥化降低了激活下游靶基因的能力。低氧時該過程受到抑制不能有效的催化結(jié)構(gòu)域內(nèi)ASN803羥基反應從而導致HIF1Α的高轉(zhuǎn)錄活性。在此基礎(chǔ)上本課題組將HIF1Α的ODDD區(qū)PRO402和PRO564以及CTAD區(qū)ASN803進行了點突變并選擇具有可轉(zhuǎn)染非增殖細胞并且轉(zhuǎn)染效率高、無致瘤性、容易獲得高滴度等優(yōu)點的腺病毒作為基因載體成功構(gòu)建腺病毒介導的三突變型HIF1ΑADHIF1ΑTRIP使其在常氧不僅能穩(wěn)定表達而且具有高轉(zhuǎn)錄活性可以促進下游血管生成因子的表達有利于誘導成熟的血管新生。盡管我們已驗證了ADHIF1ΑTRIP高生物學活性并在動物實驗中取得了成功可望應用于臨床但是腺病毒在溶液中理化性質(zhì)不穩(wěn)定、不耐熱通常需保存在含有冷凍保護劑的緩沖液中并于80℃儲存。由于運輸必須在干冰上進行、儲存冷鏈限制、使用前需要凍融等因素限制了其未來的臨床應用。冷凍干燥是將含水物料低溫冷凍使之凍結(jié)然后在低溫、高真空條件下使冰轉(zhuǎn)變?yōu)樗魵獬プ杂伤龠M行第二次干燥除去部分吸附于固體間隙中的結(jié)合水的干燥方法。其優(yōu)點和意義在于冰的升華帶走熱量使凍干整個過程保持低溫凍結(jié)狀態(tài)因此非常適用于熱敏具有生物活性藥品的干燥；真空狀態(tài)可以對藥品起到抗氧化的作用；而干燥后的物質(zhì)含水量非常少、重量輕有利于在04℃甚至室溫條件下保存和運輸；使用方便加蒸餾水或生理鹽水制成溶液即可恢復到凍干前的狀態(tài)。在凍干過程以及儲存過程均存在影響藥品穩(wěn)定性的因素需要添加凍干保護劑而不同的物料由于其結(jié)構(gòu)和組分的差異凍干保護劑也不盡相同選擇合適的凍干保護劑是制備出高質(zhì)量凍干產(chǎn)品的關(guān)鍵。此外ADHIF1ΑTRIP用于基因治療需要通過實驗考察凍干后ADHIF1ΑTRIP的生物學活性。目的篩選合適的凍干保護劑制備凍干ADHIF1ΑTRIP觀察其在04℃條件下保存長期穩(wěn)定性并且考察凍干后ADHIF1ΑTRIP的生物學活性為ADHIF1ΑTRIP將來臨床應用提供劑型方面的實驗依據(jù)。方法1將重組腺病毒載體ADHIF1ΑTRIP、ADNULL以及ADLACZ在低代HEK293A細胞中進行病毒擴增；氯化銫濃度梯度離心透析純化；純化后提取病毒DNA進行PCR檢測同時行基因測序進行鑒定；終點稀釋法測定病毒滴度。2初選3組處方其組成WVA10％海藻糖、05％明膠、3％山梨醇B10％蔗糖、05％明膠、3％山梨醇；C5％海藻糖、5％蔗糖、05％明膠、3％山梨醇；按照上述保護劑分組的百分比要求加入到磷酸鹽緩沖液中分別與稀釋的ADHIF1ΑTRIP原液按11比例混合05ML西林瓶分裝以適當凍干曲線進行凍干。根據(jù)凍干后物理性狀、病毒滴度測定篩選凍干保護劑。進行加速熱穩(wěn)定性試驗并在凍干后1天以及第3、6、12個月測定病毒滴度觀察凍干ADHIF1ΑTRIP熱穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。3ADLACZ以不同轉(zhuǎn)染復數(shù)MOI轉(zhuǎn)染微血管內(nèi)皮細胞HMVECS經(jīng)XGAL染色法測定重組腺病毒轉(zhuǎn)染效率。96孔板培養(yǎng)HMVECS凍干前ADHIF1ΑTRIP、凍干后ADHIF1ΑTRIP分別以最佳MOI轉(zhuǎn)染細胞在轉(zhuǎn)染后第24487296120小時用MTS方法檢測測細胞增殖的情況。4分別在ADHIF1ΑTRIP凍干后1天、凍干后6月、凍干后12月時間點提取病毒DNA進行PCR及PCR產(chǎn)物測序鑒定三突變型HIF1Α基因；并在上述3個時間點以ADHIF1ΑTRIP轉(zhuǎn)染HMVECS提取72小時蛋白進行WESTERNBLOT檢測HIF1Α蛋白的表達及下游VEGF蛋白的表達與液體ADHIF1ΑTRIP加以比較。5應用SPSS130統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析計量數(shù)據(jù)以X±S表示。凍干后不同保護劑組間ADHIF1ΑTRIP滴度比較采用單向方差分析方差齊時組間多重比較采用LSD法方差不齊時采用GAMESHOWELL檢驗；各組凍干前后滴度比較采用單樣本T檢驗。凍干后腺病毒加速熱穩(wěn)定性試驗、長期穩(wěn)定性試驗所測得滴度、MTS測得吸光度值組間比較及組內(nèi)不同時間比較采用重復測量的方差分析多重比較采用LSD法；加速熱穩(wěn)定性試驗同一時間點組間比較采用兩獨立樣本T檢驗長期穩(wěn)定性試驗、MTS測得吸光度值組間比較采用單向方差分析。P結(jié)果1在HEK293A細胞內(nèi)反復擴增后獲得重組腺病毒ADHIF1ΑTRIP、ADNULL和ADLACZ經(jīng)氯化銫純化后終點稀釋法測得的滴度分別為126LGPFUML、112LGPFUML、103LGPFUML。提取ADHIF1ΑTRIP病毒DNAPCR檢測HIF1Α基因得到預期的380BP、460BP、214BP的目的片段且DNA測序結(jié)果符合實驗要求。2以10％海藻糖、05％明膠、3％山梨醇保護劑制備的凍干腺病毒外觀呈白色餅塊狀殘余水分含量3ADLACZ以不同MOI轉(zhuǎn)染HMVECSXGAL染色結(jié)果顯示當MOI為100PFUCELL時重組腺病毒的感染效率趨于穩(wěn)定均在75％以上。MTS檢測顯示液體ADHIF1ΑTRIP和凍干ADHIF1ΑTRIP對HMVECS增殖無顯著差異P005但均與空白對照組之間有顯著差異P4經(jīng)PCR及基因測序鑒定凍干后1天、6月、12月的腺病毒所攜帶的目的基因信息無丟失或變異；WESTERNBLOT結(jié)果顯示凍干后1天、6月、12月的ADHIF1ΑTRIP與液體ADHIF1ΑTRIP轉(zhuǎn)染HMVECS后HIF1Α蛋白以及VEGF蛋白表達量與相當且均高于ADNULL組表達水平。結(jié)論1本課題組構(gòu)建的重組腺病毒載體ADHIF1ΑTRIP、ADNULL和ADLACZ擴增后能獲得較高的滴度且轉(zhuǎn)染效率高為下一步實驗提供了保證。2以合適的保護劑制備凍干ADHIF1ΑTRIP能達到較滿意的凍干效果。凍干后ADHIF1ΑTRIP在04℃條件下能夠長期穩(wěn)定保存。3凍干后ADHEF1ΑTRIP仍具有良好的促進HMVECS增殖。4凍干能夠長期保持ADHIF1ΑTRIP的高生物活性。

簡介：A型流感病毒是引起流行性感冒的主要病原體，具有高度變異性，能夠感染人和多種動物，常常引起流感大流行，造成嚴重的損失和傷亡。而其中的H5N1亞型具有高致病性，能夠跨種族傳播，引起了全球的廣泛關(guān)注與重視。A型流感病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1是其傳播與感染過程中的重要毒力因子，在感染細胞中有高水平的表達，能夠通過多種RNA蛋白相互作用和蛋白蛋白相互作用幫助病毒復制，阻止被感染細胞凋亡以及拮抗宿主的免疫系統(tǒng)進攻。NS1蛋白全長包含兩個結(jié)構(gòu)域，一個是N端的RNA結(jié)合區(qū)（RBD），NS1通過該結(jié)構(gòu)域與病毒MRNA相互作用，調(diào)節(jié)病毒特異性蛋白的翻譯，從而增強病毒的復制另一個是C端的效應區(qū)ED，NS1通過該結(jié)構(gòu)域和其他蛋白相互作用來阻斷宿主Ⅰ型干擾素IFN的組裝，抑制干擾素誘導蛋白的激活，從而逃避或拮抗宿主的免疫系統(tǒng)。同時，NS1蛋白能夠與多種其他蛋白相互作用，參與細胞內(nèi)多種信號通路的傳導，如NS1能夠與CRK家族蛋白相互作用激活PI3K信號通路?？梢钥闯觯琋S1作為一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，對流感病毒的毒性起著至關(guān)重要的作用。因此解析H5N1亞型NS1蛋白全長的晶體結(jié)構(gòu)以及其與相互作用蛋白復合物的晶體結(jié)構(gòu)對于我們進一步了解A型流感病毒的致病機制具有重要意義，為研究開發(fā)更有效的流感病毒抑制劑提供結(jié)構(gòu)生物學依據(jù)。本課題中我們通過分子克隆技術(shù)，將NS1蛋白的全長野生型基因序列和突變型基因序列構(gòu)建到原核表達載體PGEX4T1和PET28A中。采用原核表達系統(tǒng)重組表達可溶的目的蛋白，提取后采用親和層析和凝膠排阻層析對目的蛋白進行純化，獲得高純度高濃度的目的蛋白，最后通過蒸汽擴散法對目的蛋白進行結(jié)晶條件的初篩。同時，進行了NS1蛋白與CRKⅠ蛋白的相互作用復合物的純化實驗。

簡介：目的H3N2型流感病毒常不定期的引起不同程度的爆發(fā)流行，因該病毒的高變異性，目前的疫苗株對已發(fā)生抗原突變的病毒株不能產(chǎn)生有效的保護。通過對2010～2015年杭州地區(qū)甲型流感H3N2進行分子流行病學調(diào)查，實現(xiàn)對該病毒菌株的分子變化進行監(jiān)測，并為疾病的防控提供可靠的科學證據(jù)。方法12010年1月至2015年9月浙江大學附屬第一醫(yī)院流感監(jiān)測網(wǎng)絡相關(guān)數(shù)據(jù)，各年度流感樣病例分別為2406例、995例、766例、1156例、1928例和404例。分別采用研究試劑所有病例的咽拭子均分離到H3N2流感病毒，并經(jīng)過血凝抑制實驗和流感病毒核酸監(jiān)測證實。2參考ANEWYK3922004H3N2毒株，設(shè)計擴增H3N2各個片段的全編碼區(qū)序列引物，通過PCR的方法對疑似患者進行擴增測序3序列收集所有H3N2的HAHEMAGGLUTININ與NANEURAMINIDASE基因完整序列均在GISAID及NCBI上搜索查找獲取。在GISAID數(shù)據(jù)庫上搜索關(guān)鍵詞分別為“H3N2”，“ASIA”，“CHINA”，“HANGZHOU”，“HA”或“H3N2”，“EUROPE”，“SWITZERL”“HA”“H3N2”“NTHAMERICA”“UNITEDSTATES”“TEXAS”“HA”“H3N2”，“OCEANIA”，“AUSTRALIA”，“VICTIA”，“HA”在NCBI數(shù)據(jù)庫中的“NUCLEOTIDE”中搜索“H3N2”，“HA”，“NA”，并查找“HANGZHOU”4HA與NA基因序列篩選與比對依據(jù)病毒的分離地、時間、宿主為前提條件進行整合，條件相同序列只取一條。H3N2基因序列按照地區(qū)分為杭州及WHO推薦的20132015年流行疫苗株ATEXAS502012H3N2、20132014年流感疫苗株AVICTIA3612011和20152016疫苗株ASWITZERL97152932013E53作為參考毒株的HA和NA兩組。分組的序列分別用軟件CLUSTALXV18進行比對、分析、剪切對齊。序列比對完成后，直接運用MEGAV52軟件，采用NEIGHBJOING法進行系統(tǒng)進化樹分析。用FIGTREE軟件對圖形進行編輯。結(jié)果12010～2015年杭州地區(qū)H3N2亞型的核酸陽性人數(shù)分別為73、42、40、33、62、30，H3N2亞型核酸陽性率分別為303％、422％、567％、285％、377％、434％。22010～2015年杭州地區(qū)H3N2感染率分析，不同年度間H3N2感染率差異具有統(tǒng)計學意義X226266，P＜005，不同性別和年齡組間差異無統(tǒng)計學意義X27168，X212954P＞005。32015年HA序列分析結(jié)果表明，該年度沒有形成新的病毒。4通過對2010～2013年的NA序列進行分析，發(fā)現(xiàn)該序列高度保守。結(jié)論2010～2015年杭州甲型流感病毒H3N2占流感總陽性的469％，且絕大多數(shù)的病毒株屬于3C組。每年的冬春季節(jié)為杭州市H3N2流感流行期。由于3C2和3C3A病毒株間很少有抗原交叉，因此分支3C3A中疫苗株ASWITZERL97152932013參考株可能無法提供針對流行組3C2病毒所需的保護。2015年1月～9月病毒株研究結(jié)果顯示，2015年分離株抗原決定簇在A區(qū)和B區(qū)有多個位點發(fā)生了變異，雖未形成新的亞型，但其他位點的變異正在加強。本文對2010年～2013年杭州H3N2亞型流感病毒NA基因的序列進行測定，該基因的進化路徑主要是以一進化主干伴隨著多側(cè)支的方式進化。但2012～2013年的毒株在進化樹上沒有循序漸進的過程，進化呈現(xiàn)跳躍的方式，同一年代毒株可分為幾個分支同時存在，這些分支在進化樹上的位置有高有低，進化中由于免疫壓力和病毒自身進化因素的影響，某些分支會成為進化的主流。以往研究表明，NA的酶活性中心氨基酸是病毒和受體相互作用的主要因素，該中心位點序列是高度保守的，與病毒的繁殖能力有著直接的關(guān)系。本研究也證實了NA的酶活性中心位點是高度保守的。作為NA抑制劑藥物作用的位點，它的保守也意味著杭州2010～2013年間在基因序列上沒有發(fā)現(xiàn)耐藥毒株。

簡介：東北農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文一株H3N2亞型犬流感病毒的分離鑒定及其生物學特性的研究姓名張旭申請學位級別碩士專業(yè)獸醫(yī)學；臨床獸醫(yī)學指導教師王洪斌20110620ABSTRACTISOLATIONANDCHARACTERIZATIONOFANH3N2CANINEINFLUENZA碭而SABSTRACTCANINEINFLUENZAISAHIGHLYINFECTIOUSVIRALDISEASECAUSEDBYCANINEINFLUENZAVIRUSBELONGINGTOSUBTYPEH3N2ANDH3N8UPTONOWWEDON’TKNOWWHETHERHUMANBEINGSANDOTHERMAMMALSAREINFECTEDWITHCANINEVIRUS，WHOSENATURALHOSTS，DOGSARECONSIDEREDASHUMANBEING’SCLOSESTFRIENDFORTHEPREVENTIONANDCONTROLOFCANINEINFLUENZA，ITISIMPORTANTTOMAKECLEARTHEBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFCANINEINFLUENZAVIRUSOURSTUDIESFOCUSEDONZ『H3N2AH3N2CANINEINFLUENZAVIRUSISOLATEDFROMADEADTIBETANMASTIFFBOUGHTFROMADOGEXHIBITIONINZHEJIANGPROVINCE，CHINAWECOMPAREDTHENUCLEOTIDESEQUENCEOFALLTHEEIGHTGENESEGMENTSOFZJH3N2WITHOTHERSREFERENCEVIRUSINGENEBANK，NLERESULTSINDICATEDTHATTHESEQUENCEOFALLEIGHTGENESOFZJH3N2WEREHIGHLYHOMOLOGOUSTOKOMAH3N2INFLUENZAVIRUSESKOREA07ANDGUANGDONGH3N2INFLUENZAVIRUSESGD07DOGINFECTIONSTUDIESSHOWEDTHATARTIFICIALLYINFECTEDDOGSAPPEAREDSANLECLINICALSYMPTOMSASNATURALLYINFECTEDDOGSALLDOGSINFECTEDSHOWEDDEPRESSION，LOSTOFAPPETITE，HIGHFEVERANDCOUGHTWODOGSWEREEUTHANIZED4DAYSPOSTINFECTIONANDTISSUESWERECOLLATEDFORHISTOPATHOLOGICALSTUDYANDVIRALISOLATIONTHEHISTOPATHOLOGIEALTESTSHOWEDTHATLUNGHADOBVIOUSLYINFLAMMATORYEXUDATIONANDHEMORRHAGEVIRALTITERSINLUNGTISSUESGOTTO1047SEID50／GNEREMAININGINFECTEDDOGSRECOVEREDWITHOUTANYTREATMENTTHECANINEINFLUENZAVIRUSCOULDTRANSMITFROMDOGTODOGBYAIRANDTHEDOGSGOTFEVER4DAYSPOSTCONTACTANDAPPEAREDSIMILARSYMPTOMSASINFECTEDDOGSINORDERTOKNOWWHETHEROTHERANIMALSWEREINFECTEDWITHZJH3N2WBUSEDBALB／CMICEGUINEAPIGANDDUCK嬲THEANIMALMODELSNEMICEBEGANTOLOSTWEIGHTAFTER2DAYSINFECTEDWITH106EIDS0ZJH3N2VIRUSZJH3N2VIRUSCOULDREPLICATEINTHENASALTISSUE，TRACHEAANDLUNGSOFMICEBUTDIDNOTKILLMICEZJH3N2VIRUSCOULDREPLICATEINNASALTISSUEOFGUINEAPIGWHILENOVIRUSWASRECOVEREDFROMANYTISSUEOFDUCKS4DAYSAFTERTHEANIMALSWEREINFECTEDWITHIO。EIDS0ZJH3N2‘INSUMMARYWEISOLATEDANDIDENTIFIEDALLH3N2CANINEINFLUENZAVIRUSANDITSBIOLOGICALCHARACTERISTICSWERESTUDIEDINDETAILTHERESULTSHOWEDTHATZJH3N2V_IIUSHIGHLYHOMOLOGOUSTOKOMAH3N2INFLUENZAVIRUSESKOREA07ANDGUANGDONGH3N2INFLUENZAVIRUSESGD07，WHICHWEREORIGINALLYCOMEFROMAVIANINFLUENZAVIRUSTHISSTUDYALSOPROVEDTHATZJH3N2COULDREPLICATEINOTHERMAMMALSBESIDESDOGS，BUTNOTINDUCKSTHERESULTCOMPLEMENTEDTHEKNOWLEDGEOFEPIDEMIOLOGYOFCANINEINFLUENZAVIRUS，ANDSUPPLYMATERIALANDTHEANIMALMODELFORTHESTUDIESOFINTERSPECIESTRANSMISSIONOFINFLUENZAVIRUSN

簡介：目錄目錄IULLIILLHILLLLILULIIILLLULY2772202摘要?????????????????????????????????????????????I英文摘要?????????????????????????????????III1引言?????????????????????????????????????????L1．1本研究課題的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動態(tài)分析???????????????11．1．1雞馬立克氏病和雞馬立克氏病病毒??????????????????11．1．2BIDV的傳播及感染??????????????????????????21．1．3LVIDV基因組及致瘤基因???????????????????????31．1．4IVIDV的進化及機制????????????????????????71．2本研究課題的目的和意義???????????????????????102材料和方法??????????????????????????????112．1實驗材料?????????????????????????????112．1．1病毒株、血清和單抗???????????????????????112．1．2主要試劑??????????????????????????????????1L2．1．3主要耗材????????????????????????????112．1．4實驗動物?????????????????????????????1L2．1．5儀器???????????????????????????????????????122．2實驗方法???????????????????????????????122．2．1MD的流行病學及MDV與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查?????????122．2．2MDV野毒株分離與鑒定??????????????????????．142．2．3MDV野毒株MEQ基因序列測定及分析????????????????152．2．4MDV野毒株致病性分析??????????????????????．152．2．5MDVREV分離物致病性分析????????????????????172．2．6分離物CYMR中MDV的BAC克隆的構(gòu)建???????????????182．2．7分離物CYMR中MDV的BAC克隆的基因組序列測定??????????182．2．8統(tǒng)計分析????????????????????????????193結(jié)果與分析??????????????????????????????．213．1MDV的流行病學及其與其他免疫抑制病毒的混感調(diào)查????????????213．1．1MD的檢測????????????????????????????????????2L3．1．2MDV與REV、ALV和CIAV的混合感染????????????????213．1．3MDV與REV、ALV和CIAV的多重感染情況??????????????223．2MDV野毒株與MDVREV分離物的分離與鑒定??????????????．223．2．1MDV野毒株的分離與鑒定?????????????????????．223．2．2MDVREV分離物的分離與鑒定???????????????????253．3MDV野毒株MEQ基因序列測定和分析??????????????????263．3．1MDV分離株MEQ基因序列分子特征?????????????????26COBRN強RRSCONTENTSABSTRACT???????????????????????????????????????????一IABSTRACTINENGLISH。????????‘??????????????????III1INTRODUCTION????????????????????????????????????????L1．1RESEARCHPROGRESSOFMDV???????????????????????????????’L1．1．1MDANDMDVRESEARCHBACKGROUND?????????????????????????”L1．1．2ⅣDVTRANSMISSIONANDINFECTION???????????????????????????21．1．3GENOMEOFMDV??????????????????????????????????一31．1．4MDVEVOLUTIONANDTHEFUNDAMENTALMECHANISMSOFDRIVINGVIRUSEVOLUTION?????‘71．2THEGOALANDTHEMEANINGOFTHEEXPERIMENT???????????????????????102MATERIALSANDMETHODS??????????????????????????????????1L2．1MATERIALS???????????????????????????????????????112．1．1VIRUS，SERUMANDMCAB???????????????????????????????112．1．2MAINREAGENTS????????????????????????????????????112．1．3MAINCONSUMABLES?????????????????????????????????一112．1．4EXPERIMENTALANIMALS????????????????????????????????112．1．5INSTRUMENT?????????????????????????????????????122．2METHODS????????????????????????????????????????122．2．1THEEPIDEMIOLOGYOFMDVANDPOLYINFECTIONWITHIMMUNOSUPPRESSIVEVIRUSES????‘122．2．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVANDMDVREVISOLATES??????????????‘142．2．3SEQUENCEANALYSISOFMEQGENEOFMDVISOLATES???????????????????152．2．4PATHOGENICITYOFMDVISOLATES???????????????????????????’152．2．5PATHOGENICITYOFMDVREVISOLATES????????????????????????一172．2．6CONSTUCTIONOFⅣDVBACOFCYMR????????????????????????一182．2．7GENOMEANALYSISOFMDVBACOFCYMR??????????????????????182．2．8DATAANALYSISANDPROCESSING????????????????????????????‘193RESULTSANDANALYSIS’‘213．1THEEPIDEMIOLOGYOFMDVANDPOLYINFECTIONWITHIMMUNOSUPPRESSIVEVIRUSES?????’213．1．1DETECTIONOFMDV?????????????????????????????????一213．1．2POLYINFECTIONOFMDVWITHREV,ALVANDCAV???????????????????213．1．3DOUBLE，TRIPLEORQUARINFECTIONOFMDVWITHREVALVANDCAV??????‘223．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVANDMDVREVISOLATES???????????????‘223．2．1SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVISOLATES??????????????????????‘223．2．2SEPARATIONANDDETECTIONOFMDVREVISOLATES???????????????????253．3SEQUENCEANALYSISOFMEQGENEOFM【DVISOLATES?????????????????????263．3．1MOLECULARCHARACTERIZATIONOFMEQGENEOFMDVISOLATES???????????????26III

簡介：分類號②必33㈧969㈧75Y孝中震聾夫?qū)W密級／’，博士學位論文PHDDISSERTATION核盤菌弱毒菌株AHL6所含真菌病毒及其生物學特性研究MOLECULARANDBIOLOGICALCHARACTERIZATIONOFTHEMYCOVIRUSESINSCLEROTINIASCLEROTIORUMHYPOVIRULENTSTRAINAHL6研究生CANDIDATE冉鴻昌RANHONGCHANG蠡UDE凈NT．083010NO10006STUD．1UUUU專業(yè)MAJOR植物病理學PLANTPATHOLOGY導師姜道宏教授SUPERVISORPROFESSORJIANGDAOHONG中國武漢WUHAN，CHINA二。一七年十二月DEC，2017華中農(nóng)業(yè)大學學位論文獨創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)書學位論文舀如需保密，解密時間年月日是否保密獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得華中農(nóng)業(yè)大學或其他教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料，指導教師對此進行了審定。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中做了明確的說明，并表示了謝意。研究生簽躺帆廬礦見月習曰學位論文使用授權(quán)書校要求提交學位論文的印刷本和電子版本；學校有權(quán)保存提交論文的印刷版和電子版，猁橢晰為期張妻魏簽名曰期勿77年J‘互月孑曰．簽名日期．2EJ7午L2．月冒日|

簡介：密級論文編號中國農(nóng)業(yè)科學院學位論文L型鴨肝炎病毒中國流行株生物學特性相關(guān)研究MOLECULARCHARACTERISTICSOFDUCKHEPATITISVIRUS1ISOLATEDINCHINA博士研究生劉曉麗指導教師孔憲剛研究員申請學位類別農(nóng)學博士專業(yè)預防獸醫(yī)學研究方向動物病毒分子生物學及分子免疫學培養(yǎng)單位中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院哈爾濱獸醫(yī)研究所提交日期2011年6月中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文評閱人、答辯委員會簽名表論文題目I型鴨肝炎病毒中國流行株生物學特性相關(guān)研究動物病毒分子生物學及分子論文作者劉曉麗專業(yè)預防獸醫(yī)學研究方向免疫學指導教師孔憲剛研究員培養(yǎng)單位研究所、中心哈爾濱獸醫(yī)研究所姓名職稱碩博單位專業(yè)簽名碩導口＼評博導口閱碩導口‘＼博導口人＼碩導口博導口放R1辯碩導口磚廡L主李慶章教授東北農(nóng)業(yè)大學基礎(chǔ)獸醫(yī)學席博導■碩導口鋤移厶翁長江研究員哈爾濱獸醫(yī)研究所預防獸醫(yī)學博導一碩導口／勁于力研究員哈爾濱獸醫(yī)研究所預防獸醫(yī)學。博導一放您弛口碩導口中科院昆明動物研究張華堂研究員博導一所預防獸醫(yī)學辯扈榮良教授碩導口序羞分委博導■軍事醫(yī)學科學院預防獸醫(yī)學華育平教授碩導口鐋口博導■東北林業(yè)大學預防獸醫(yī)學貝碩導口澮炊涂長春教授軍事醫(yī)學科學院預防獸醫(yī)學博導■碩導口一J／／博導口會議記錄秘書王永強論文答辯時間地點2011年6月14同哈爾濱獸醫(yī)研究所學術(shù)報告廳

簡介：在病毒性疫苗的研究開發(fā)工作中，人二倍體細胞作為病毒抗原的制備基質(zhì)是整個疫苗研發(fā)及生產(chǎn)質(zhì)量控制的首要選擇。對作為疫苗制備基質(zhì)的人二倍體細胞的遺傳穩(wěn)定性及其病毒感染生物學反應特征的相關(guān)分析，將為病毒疫苗的研究及開發(fā)包括疫苗安全性的研究提供更為豐富的資料。從細胞生物學的角度看，細胞特定酶學反應特征被認為可以反映細胞的遺傳學特性和生物學性狀?，F(xiàn)有的資料表明，當細胞面臨病毒感染時，其具有天然免疫反應性質(zhì)的生物學反應事實上是與其自身的生物學性狀相關(guān)的。其中細胞所產(chǎn)生的干擾素反應，在病毒疫苗制備技術(shù)工藝上又是一個具有重要意義的質(zhì)量指標，而該指標與細胞增殖過程中的生物學活性狀態(tài)具有直接的相互聯(lián)系。因此，分析細胞酶活性特征與其在病毒感染時的干擾素反應強度，顯然對這類細胞用于疫苗制備時的技術(shù)研究具有重要的意義。因此本文采用多種細胞系，多代細胞，通過生化方法檢測細胞內(nèi)乳酸脫氫酶、超氧化物歧化酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力變化以鑒定細胞的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，人胚肺二倍體細胞（KMB17細胞）和新型的人胚肺二倍體細胞（N0細胞）在細胞代次超過30代后，細胞內(nèi)的酶活力會發(fā)生一定的變化，乳酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶的酶活力上升，超氧化物歧化酶的酶活力下降，表明這兩種細胞在細胞代次超過30代后，細胞的增殖、代謝等能力會下降，細胞穩(wěn)定性較差，不利于用于疫苗的研發(fā)和生產(chǎn)。VERO細胞和HELA細胞隨著細胞代次增加酶活力無明顯變化，表明這兩種細胞在實驗所采用的細胞代次內(nèi)，細胞的增殖、代謝等能力基本保持穩(wěn)定。本文重點分析了各種酶活性指標的變化與細胞在RNA病毒和DNA病毒感染時所產(chǎn)生的干擾素反應的相互聯(lián)系，以及這些相互聯(lián)系所導致的病毒感染滴度的變化情況。做為在細胞核內(nèi)完成增殖和在細胞質(zhì)內(nèi)完成增殖的HSV1病毒和EV71病毒感染人胚肺二倍體細胞KMB17、N0時，其引起IFNΑ的相對表達量與細胞的酶活力、細胞的生長狀態(tài)有很大的關(guān)系。當人胚肺二倍體細胞培養(yǎng)到第3天時，細胞酶活力處于上升階段，細胞的生長狀態(tài)較好，當細胞培養(yǎng)到第5天時，細胞酶活力處于穩(wěn)定狀態(tài)，細胞的生長狀態(tài)也維持相對穩(wěn)定，兩種病毒感染培養(yǎng)到第5天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量比感染培養(yǎng)到第3天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量高，而病毒滴度在感染過程中逐漸上升，但隨著干擾素分泌的增加而其增殖逐漸變低的事實，提示了人二倍體細胞在病毒增殖過程中所具有的容納限度，可能與干擾素的產(chǎn)生濃度相關(guān)。當兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天和第5天的HELA細胞時，其引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量與細胞的酶活力關(guān)系不大，且比感染其他種類細胞分泌的IFNΑ的相對表達量低，這提示了該細胞作為一種腫瘤細胞的非限制型特征。反之，兩種病毒感染培養(yǎng)到第3天的VERO細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量比感染培養(yǎng)到第5天細胞引起細胞分泌的IFNΑ的相對表達量高，且病毒滴度前者也高于后者。這一特征有別于人二倍體細胞，似乎提示了VERO細胞的生物學特性，這些通過研究病毒感染后引起細胞分泌的IFNΑ相對表達量的變化與細胞酶活力、細胞生長狀態(tài)之間的關(guān)系的工作，雖然這需要進一步的確證和分析，但相關(guān)的數(shù)據(jù)將又為疫苗的研究和制備提供相應的實驗依據(jù)。

簡介：目的慢性乙型肝炎病毒HEPATITISBVIRUS，HBV感染是全球性的公共衛(wèi)生問題，目前大約有4億人為慢性感染，每年因HBV感染所致相關(guān)肝病死亡的患者大約有100萬人，其感染可引起一系列肝臟疾病，包括慢性乙型肝炎CHRONICHEPATITISB，CHB、肝硬化LIVERCIRRHOSIS，LC和肝細胞癌HEPATOCELLULARCARCINOMA，HCC等?？共《局委熓荂HB患者最為根本也是最為重要的治療?？共《局委煹亩唐谀繕耸且种埔倚透窝撞《镜膹椭?，對于HBEAGHEPATITISB“E”ANTIGEN陽性的CHB患者同時需要獲得HBEAG血清學轉(zhuǎn)換。長期目標就是減慢或阻止肝臟疾病向LC、HCC方向發(fā)展，提高患者的生活質(zhì)量和患者的生存率。目前，抗HBV的藥物主要有兩類，一類是注射用的干擾素制劑，另外一種是口服核苷（酸）類藥物NUCLEOSTIDENNALOGUES，NAS。NAS是乙型肝炎病毒HBVRNA依賴性DNA多聚酶的抑制劑，可以直接抑制病毒的復制，從而降低體內(nèi)的病毒水平。NAS由于是口服藥，每日一次服用，與注射用干擾素相比，使用比較方便，且安全性好，適合長期使用。在中國，目前可以選擇的口服NAS藥物有五種，包括拉米夫定LAM、阿德福韋酯ADV、恩替卡韋ETV、替比夫定LDT和替諾福韋酯TDF。隨著口服核苷類藥物在臨床實踐中的廣泛使用，越來越多的臨床問題亟待解決。例如患者對長期抗病毒治療的接受程度及依從性問題、經(jīng)濟負擔、長期治療的副作用問題、育齡期患者的生育安全問題以及長期服用帶來的耐藥性問題等。迄今為止，還沒有確切的循證醫(yī)學證據(jù)可以科學地指導NAS抗HBV治療的合理療程，同時也缺乏一個可靠的實驗室檢查指標來指示是否可以停藥或何時停藥。療程問題是困擾患者和臨床醫(yī)生的重要問題，也是影響患者依從性的主要障礙。雖然，歐洲及美國肝病指南推薦HBSAG發(fā)生血清學轉(zhuǎn)換后可以考慮停藥，但核苷（酸）類藥物治療發(fā)生HBSAG血清學轉(zhuǎn)換的機率是極低的。事實上，這一推薦也難在臨床上廣泛應用，其中的原因之一是按目前指南標準停藥，停藥后復發(fā)率較高，原因之二就是指南本身的推薦意見尚缺乏高質(zhì)量的循證醫(yī)學證據(jù)。此外，NAS雖然能有效地抑制HBV的復制，但是由于其不能清除肝細胞內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA（COVALENTLYCLOSEDCIRCULARDNA，CCCDNA）。正因為如此，很多患者在停藥后很快出現(xiàn)病毒復制，甚至出現(xiàn)臨床復發(fā)。雖然NAS何時能夠停藥仍然飽受爭議，但是卻是臨床上非常關(guān)注的一個問題。因此，有必要尋找和探索有關(guān)停藥后預測復發(fā)的臨床指標，盡可能將停藥后復發(fā)風險降到最低。為此我們展開了本次前瞻性研究，目的是為了尋找和探索預測停藥后持久應答的指標，尋求最佳停藥終點以降低復發(fā)風險。方法本次研究是一項前瞻性、單中心、觀察性研究，入組的都是亞洲CHB患者（HBSAG陽性＞6月），停藥時病毒都得到了很好的控制并且自愿停藥進入隨訪觀察。入組的患者都來自南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院門診或住院患者，所有入組分析的患者停藥隨訪時間都至少達到了6個月。計量單位采用均數(shù)±SD或中位數(shù)和四分位間距IQR表示，計數(shù)單位采用百分比表示。對于數(shù)值變量我們采用的是X2檢驗，對于連續(xù)性變量酌情采用T檢驗或曼惠特尼檢驗。多因素COX風險比例回歸模型分析可以預測研究終點的相關(guān)因素。為了研究在初次HBVDNA＞2000IUML的HBVDNA水平對生物化學復發(fā)的預測因素，我們采用了伴時COX回歸模型分析，對于第一次HBVDNA上升的時間定義為T0。持續(xù)性HBVDNA上升作為一個伴時變量進行分析，允許患者從非持續(xù)HBVDNA上升轉(zhuǎn)換到持續(xù)性HBVDNA上升組。結(jié)果一、入組人群截止到2015年7月，總共有87例患者滿足了停藥標準并且簽訂了停藥協(xié)議進入停藥隨訪研究，并且停藥時間至少6個月。其中有5例患者停藥時HBSAG為陰性，沒有納入本次分析。共有82例停藥時HBSAG陽性并且HBVDNA陰性的患者納入了本次分析。入組的82例停藥患者中，男性患者73例，女性患9例。其中既往有使用過NAS藥物的有19例，初次NAS治療的有63例。此外，既往有干擾素治療史的患者有18例。本次停藥患者中，使用一線抗病毒藥物ETV的患者有32例，使用二線抗病毒藥物（NONETV，包括LAM、ADV、LDT和LAMADV）有50例。停藥患者的平均年齡為35±84歲，抗病毒治療時間的中位數(shù)為40年（四分位間距2540），鞏固治療時間的中位數(shù)為23年（四分位間距1439）。在開始NAS治療前，60例73％為HBEAG陽性患者，22例27％為HBEAG陰性患者。治療前為HBEAG陽性與治療前為HBEAG陰性的患者的人口學數(shù)據(jù)和臨床特點進行比較發(fā)現(xiàn)，只有停藥時患者的年齡和鞏固治療時間具有統(tǒng)計學差異。治療前為HBEAG陽性患者平均年齡為34±81歲，要小于治療前HBEAG陽性患者的40±78歲P0002治療前HBEAG陰性患者鞏固治療時間中位數(shù)為29年（四分位間距1851），明顯的要大于治療前為HBEAG陽性患者的21年（四分位間距1235）P0043。本次分析納入的82例停藥隨訪患者依從性良好，只有2例患者失訪，失訪的時間分別為24周和60周。對于沒有發(fā)生臨床復發(fā)的患者，隨訪時間的中位數(shù)為19年（四分位間距1425）。二、病毒學復發(fā)及預測因素在停藥隨訪過程中，總共有58例患者發(fā)生了病毒學復發(fā)。對于治療前為HBEAG陽性的患者，停藥后05年、1年和2年的累積病毒學復發(fā)率分別為65％、69％和73％，而對于治療前為HBEAG陰性的患者停藥后05年、1年和2年的累積病毒學復發(fā)率分別為55％、64％和77％，兩組患者之間的累積病毒學復發(fā)率沒有統(tǒng)計學差異P086。COX風險比例回歸模型分析顯示只有治療藥物是病毒學復發(fā)的相關(guān)因素。多因素分析中，使用二線抗病毒藥物NONETV發(fā)生病毒學復發(fā)可能性是使用一線抗病毒藥物ETV的2倍HR196，95％CI107359，P0028。停藥2年時，停藥前使用ETV與NONETV治療的患者累積病毒學復發(fā)率分別為6460％和8027％，兩者之間具有統(tǒng)計學差異P00135。三、臨床復發(fā)及預測因素停藥隨訪中，共有28例患者發(fā)生臨床復發(fā)，其中有16例57％患者臨床復發(fā)時ALT＞5ULN。對于治療前為HBEAG陽性的患者，停藥后05年、1年和2年的累積臨床復發(fā)率分別為14％、26％和31％對于治療前為HBEAG陰性的患者停藥05年、1年和2年的累積臨床復發(fā)率分別為14％、27％和53％。HBEAG陽性與HBEAG陰性兩組之間的累積臨床復發(fā)率沒有統(tǒng)計學差異P0099。四、生物化學復發(fā)的預測因素停藥隨訪過程中總共有58例患者發(fā)生過病毒學復發(fā)。在這58例患者之中，有31例患者發(fā)生了生物化學復發(fā)，停藥2年時累積生物化學復發(fā)率為65％。對于停藥后持續(xù)性HBVDNA≤2000IUML的24例患者，在停藥隨訪時間的中位數(shù)為2年（四分位間距為1325）的過程中沒有一例患者發(fā)生了生物化學復發(fā)。結(jié)論1本次研究表明NAS停藥后，病毒學復發(fā)是非常普遍的。COX風險比例回歸模型分析示抗病毒藥物是病毒學復發(fā)的相關(guān)因素，使用一線抗病毒藥物ETV治療的患者停藥后發(fā)生病毒學復發(fā)的風險低。2治療前HBEAG的狀態(tài)對停藥后的病毒學復發(fā)及臨床復發(fā)沒有影響。3多因素COX風險比例回歸模型分析發(fā)現(xiàn)只有年齡是臨床復發(fā)的相關(guān)因素，HBSAG雖然不是臨床復發(fā)的相關(guān)因素，但是停藥時HBSAG≤200IUML的患者發(fā)生臨床復發(fā)的可能性更小。4停藥2年的FIBROSCAN及肝臟超聲檢測結(jié)果表明患者停藥后沒有肝臟組織學進展。5停藥后HBVDNA水平以及持續(xù)性HBVDNA上升是生物化學復發(fā)的危險因素。由于停藥后存在極高的生物化學復發(fā)風險，對于停藥后HBVDNA上升超過200000IUML的患者應該直接進行抗病毒治療，無論患者的ALT水平是否超過了2倍的正常上限ULN對于停藥后HBVDNA水平在2000200000IUML之間，同時伴有ALT＞2ULN的患者，為了防止進一步的肝臟損害，應該再次行抗病毒治療對于HBVDNA水平在2000200000IUML之間，而ALT≤2ULN的患者，可以在13個月內(nèi)再次檢測HBVDNA，如果HBVDNA依然超過2000IUML（持續(xù)性HBVDNA上升），由于存在較高的生物化學復發(fā)率，應該再次行抗病毒治療，如果HBVDNA＜2000IUML可以繼續(xù)隨訪觀察。

簡介：分類號河南農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文論文題目英文題目密級ISOLATIONANDIDENTIEI￡蘭豎QNQ里PORCINEPARVOVIRUSA墜嬰王墜至豎S羔墮ITSB10LOGICALCHARA￡基RS衛(wèi)￡S學位申請人題』蟲導師王刖迭專業(yè)亟隨獸醫(yī)堂研究方向動物籩鎏痘蕉痘扭理壁隨圭論文提交日期學位授予日期定一一鑒一L一蠱一金一的一一掛宜猛丑南一掛河一堂壹塑病一生一羞緗一㈤糊必本論文受到下述項目資助國家高技術(shù)研究與發(fā)展計劃863項目NO2007AAL00606

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