簡(jiǎn)介：青蒿素是目前治療瘧疾的首選藥物，但天然來(lái)源受到多種因素制約，通過(guò)基因工程方法生產(chǎn)其中間體青蒿酸、進(jìn)而化學(xué)半合成青蒿素是解決資源問(wèn)題的重要途徑之一。為構(gòu)建青蒿酸高產(chǎn)酵母工程株系，本論文開(kāi)展了紫穗槐4，11二烯簡(jiǎn)稱紫穗槐烯，AD的生物合成途徑工程研究并取得如下進(jìn)展1ADS整合型釀酒酵母工程菌的構(gòu)建根據(jù)同源雙交換的原理，構(gòu)建可以在釀酒酵母的ΛDNA序列處進(jìn)行雙交換的紫穗槐4，11二烯合酶ADS基因ADS的整合載體。ΛDNA序列在釀酒酵母基因組中大約有200個(gè)拷貝，把外源基因整合在這個(gè)位點(diǎn)可以大大提高外源基因在釀酒酵母中表達(dá)的拷貝數(shù)。構(gòu)建ADS整合載體首先要把釀酒酵母的強(qiáng)啟動(dòng)子ADH和終止子連在載體上，然后把ADS基因亞克隆到強(qiáng)啟動(dòng)子ADH和終止子之間，再連接一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記基因URA3，還要把ΛDNA序列分成兩個(gè)交換臂連在所有待整合基因的兩端。用這個(gè)構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化營(yíng)養(yǎng)缺陷型釀酒酵母，篩選出ADS整合型工程菌。得到的菌株經(jīng)過(guò)發(fā)酵培養(yǎng)后，用GCMS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)計(jì)算，其中一株工程菌產(chǎn)紫穗槐烯的量達(dá)到1170MGL1。2ADS整合型工程菌和ADS附加體型工程菌AD產(chǎn)率比較將本論文構(gòu)建的ADS整合型工程菌和實(shí)驗(yàn)室以前構(gòu)建的ADS附加體型工程菌各選3株，同時(shí)發(fā)酵培養(yǎng)，然后進(jìn)行發(fā)酵液提取和GCMS檢測(cè)。結(jié)果顯示，整合型工程菌的AD產(chǎn)率明顯高于附加體型工程菌的AD產(chǎn)率P＜001。3鯊烯合酶基因SQS反義RNA表達(dá)載體的構(gòu)建設(shè)計(jì)反義RNA時(shí)，人們普遍應(yīng)用由翻譯起始位點(diǎn)向上下游延伸05KB30KB的片段作為重組質(zhì)粒的逆向插入序列，5’和3’非翻譯區(qū)UTR往往具有良好的效果。本研究把SOSMRNA的4個(gè)基因片段SQS15’UTR，SQS73’UTR，SQS3﹡45’UTR加5’編碼區(qū)以及SQS5﹡63’編碼區(qū)加3UTR分別反向插入到PYEDP60的GAL10CYC1半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建成4個(gè)相應(yīng)的SOS反義RNA表達(dá)載體PYEDSQS1、PYEDSQS7、PYEDSQS3﹡4、PYEDSQS56。4SQS反義RNA表達(dá)對(duì)AD釀酒酵母工程菌生物合成的影響用上述4個(gè)SQS反義RNA表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化ADS整合型酵母工程菌，得到含有SQS反義RNA的ADS酵母工程菌。用GCMS檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物中的AD和鯊烯SQ的量，初步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入SQS反義表達(dá)載體后，鯊烯SQ和AD的產(chǎn)率比轉(zhuǎn)入前均有所下降?？赡艿脑蚴撬治龅闹亟M菌樣本量比較少，而這些重組菌中轉(zhuǎn)入的反義基因片段除了引起SQS表達(dá)下調(diào)以外，還引起ADS表達(dá)的部分抑制。本論文還開(kāi)展了重組SARS未知功能小蛋白的大腸桿菌表達(dá)、純化及抗體制備研究5SARSCOV未知功能小蛋白的表達(dá)、純化、鑒定及抗體制備在大腸桿菌BL21TRXBDE3中，表達(dá)了重組SARSCOV未知功能小蛋白X4、X5和F10。對(duì)X5和F10重組蛋白進(jìn)行了NI親和層析純化。F10純化時(shí)，用低濃度咪唑60MML1梯度洗脫，獲得22KD和44KD兩個(gè)蛋白條帶；在用高濃度咪唑120MML1梯度洗脫時(shí)，只有分子量大小為22KD的蛋白條帶。制備這兩種條帶并送中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所進(jìn)行LCMSMS測(cè)定，結(jié)果顯示在22KD和44KD兩種蛋白樣品中均能檢測(cè)到與F10蛋白序列100％同源的若干個(gè)片段，兩種樣品所測(cè)得的片段分別占總F10蛋白序列理論值的383％和451％，由此推測(cè)所獲得的重組蛋白就是F10蛋白，其中44KD的蛋白條帶可能是該蛋白的二聚體的形式，這也很可能是病毒進(jìn)入人體后起作用的形式。在純化X5蛋白時(shí)，用和F10一樣的純化方法卻沒(méi)有得到X5蛋白，推測(cè)X5蛋白是以包涵體形式存在。用尿素變性溶解包涵體，然后所得上清用親和柱層析，TRIS緩沖液復(fù)性的辦法得到了高產(chǎn)率、高純度的蛋白。用復(fù)性后的蛋白免疫兔子得到了高效價(jià)的X5蛋白的抗血清。WESTERN免疫印跡顯示尿素變性純化再?gòu)?fù)性的X5蛋白的抗體能夠和菌體中表達(dá)的X5蛋白結(jié)合。以包涵體形式表達(dá)的X5蛋白純化后的產(chǎn)率達(dá)到933MGL1是以非包涵體形式表達(dá)的F10蛋白純化后產(chǎn)率的5倍。

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簡(jiǎn)介：目的股骨頭缺血性壞死是骨科常見(jiàn)疾患，股骨頭壞死是由于股骨頭內(nèi)壓力增高，股骨頭骨組織不能得到營(yíng)養(yǎng)血管的正常供血，使股骨頭組織中的骨細(xì)胞、骨髓、造血細(xì)胞、其他細(xì)胞發(fā)生壞死。治療股骨頭壞死是當(dāng)今世界的一大難題，股骨頭壞死的主要原因是由于股骨頭的血運(yùn)被破壞，從而引起了骨細(xì)胞及骨髓成分死亡及隨后的修復(fù)，繼而導(dǎo)致股骨頭結(jié)構(gòu)改變、股骨頭塌陷、關(guān)節(jié)功能障礙的疾病。本實(shí)驗(yàn)主要是應(yīng)用組織工程技術(shù)，構(gòu)建組織工程化骨來(lái)評(píng)估體內(nèi)血管化的過(guò)程，進(jìn)而為重建股骨頭的血運(yùn)提供一種可行性方案。本實(shí)驗(yàn)取新西蘭大白兔的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，應(yīng)用富血小板血漿PRP進(jìn)行體外培養(yǎng)，然后與生物相容性好的支架材料ΒTCP結(jié)合進(jìn)行培養(yǎng)，由于ΒTCP三維空間具有更多的延伸方向，有助于控制干細(xì)胞生長(zhǎng)行為，提高單位擴(kuò)增速率，適于在微重力體系中模擬體內(nèi)組織細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境，適應(yīng)剪切力，促進(jìn)骨分化。另一方面，ΒTCP本身可以作為一種很好的存貯和控釋給藥系統(tǒng)，在培養(yǎng)過(guò)程中逐步釋放骨誘導(dǎo)生長(zhǎng)因子。最后將復(fù)合體放入生物反應(yīng)器中進(jìn)行三維培養(yǎng)，構(gòu)建組織工程化骨，將構(gòu)建的組織工程化骨植入動(dòng)物體內(nèi)，3月后處死動(dòng)物，取材，標(biāo)本觀察，PCR及ELISA等實(shí)驗(yàn)技術(shù)來(lái)觀察血管特異性標(biāo)志物，從而用來(lái)評(píng)價(jià)該種構(gòu)建組織工程化骨對(duì)于血管化的影響，從而為重建股骨頭血運(yùn)提供一種可行性方案。材料和方法1取23月齡的健康的新西蘭大白兔，麻醉好后放于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，備皮，固定，消毒，鋪無(wú)菌巾，在無(wú)菌條件下用穿刺針抽取雙側(cè)脛骨平臺(tái)內(nèi)下側(cè)骨髓5ML，梯度密度離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法提取BMSCS，進(jìn)行原代、傳代細(xì)胞培養(yǎng)。流式細(xì)胞儀鑒定。2經(jīng)兔耳緣靜脈抽取新鮮血液約10ML，在無(wú)菌條件下，迅速加入到盛有1ML5％枸櫞酸鈉的15ML離心管中，輕輕搖晃，防止凝固。3制備富血小板血漿PRP，將上述離心管中的血液放入離心機(jī)中，采用二次離心法制備富血小板血漿，第一次離心3300轉(zhuǎn)分，第二次離心3000轉(zhuǎn)分，然后得到無(wú)色透明的膠凍狀物質(zhì)即是富血小板血漿。4將制備的富血小板血漿加入到培養(yǎng)基中，3天換液一次，培養(yǎng)BMSCS。5將用富血小板血漿培養(yǎng)的BMSCS制成約1ML的細(xì)胞懸液，滴加到Β磷酸三鈣ΒTCP上，構(gòu)建細(xì)胞支架復(fù)合體，然后放入生物反應(yīng)器中用含有富血小板血漿的培養(yǎng)基培養(yǎng)3周。6將在生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的復(fù)合體取出，植入到新西蘭大白兔的皮下，縫合，三個(gè)月以后，取出復(fù)合體材料，然后免疫組化檢測(cè)血管標(biāo)志物CD31，第Ⅷ因子關(guān)連抗原VWF的表達(dá)。結(jié)果1對(duì)于細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化，可以采用倒置相差顯微鏡來(lái)觀察，13日后在顯微鏡下可以觀察到有少量的兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁，形狀呈不規(guī)則的短梭形。數(shù)日之后培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細(xì)胞集落群，78天后，這種細(xì)胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可基本鋪滿瓶底。鋪滿瓶底后，進(jìn)行細(xì)胞傳代，貼壁較原代細(xì)胞快，細(xì)胞核較大，胞漿內(nèi)顆粒較原代細(xì)胞多。加入富血小板血漿PRP后，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度較以前明顯加快，細(xì)胞排列規(guī)整，呈明顯的漩渦狀生長(zhǎng)。2Β磷酸三鈣ΒTCP上電鏡掃描可見(jiàn)有細(xì)胞粘附，細(xì)胞伸出偽足和Β磷酸三鈣ΒTCP相連接，細(xì)胞在ΒTCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。3實(shí)驗(yàn)組免疫組化結(jié)果顯示血管標(biāo)志物CD31，第Ⅷ因子關(guān)連抗原VWF呈強(qiáng)陽(yáng)性表現(xiàn)。4富血小板血漿富含多種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)成骨或軟骨，可以促進(jìn)血管化的過(guò)程。結(jié)論1原代細(xì)胞培養(yǎng)一天后，于倒置相差顯微鏡下觀察可見(jiàn)有細(xì)胞貼壁，呈小圓形。第二天可見(jiàn)有不規(guī)則性的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞貼壁，三日后，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，呈不規(guī)則的短梭狀（圖3）。一周后，細(xì)胞體積明顯增大，培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)細(xì)胞集落群，數(shù)日后，這種細(xì)胞集落群廣泛出現(xiàn)。兩周以后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可基本鋪滿瓶底，呈螺旋簇狀生長(zhǎng)（圖4），細(xì)胞可基本長(zhǎng)滿瓶底，生長(zhǎng)均勻，細(xì)胞伸展充分，形態(tài)均一，并開(kāi)始向多角型細(xì)胞轉(zhuǎn)化，呈明顯的旋渦狀生長(zhǎng)。2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是組織工程中較理想的種子細(xì)胞。因?yàn)楣撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源比較豐富，取材也方便，同時(shí)分離方法也較簡(jiǎn)單，采用淋巴細(xì)胞分離液可以分離大量的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有穩(wěn)定的體外培養(yǎng)性能，并且易于傳代。3富血小板血漿富含多種細(xì)胞因子，可以誘導(dǎo)成骨或軟骨，可以促進(jìn)血管化的過(guò)程。4Β磷酸三鈣ΒTCP在組織工程支架材料的選擇方面具有較多的優(yōu)勢(shì)，由于其較好的組織相容性和三維立體結(jié)構(gòu)，所以，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞適合于在Β磷酸三鈣ΒTCP支架材料上黏附和增殖。5灌注型生物反應(yīng)器對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生力學(xué)刺激，可以使細(xì)胞在三維支架材料上更好的黏附和增殖。

簡(jiǎn)介：松果菊苷既是一種咖啡酸類(lèi)衍生物，也是一種苯乙醇苷類(lèi)化合物，具有多種藥理學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、神經(jīng)保護(hù)作用、保肝作用以及對(duì)免疫系統(tǒng)產(chǎn)生刺激作用。松果菊苷最早發(fā)現(xiàn)于狹葉松果菊，其含量約為02％，后亦在克氏釣鐘柳中發(fā)現(xiàn)，含量約為009％。目前，松果菊苷主要從一種寄生于梭梭的管花肉蓯蓉中提取。在2005版中華人民共和國(guó)藥典中，管花肉蓯蓉的唯一質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)是，松果菊苷的含量不低于1O％。管花肉蓯蓉只分布于沙漠和戈壁一帶，生長(zhǎng)緩慢，且難于栽種。然而，近年來(lái)隨著松果菊苷商業(yè)價(jià)值的不斷提高，管花肉蓯蓉的市場(chǎng)需求也在不斷增長(zhǎng)，管花肉蓯蓉被過(guò)度開(kāi)發(fā)，已經(jīng)成為瀕危植物。因此，尋找管花肉蓯蓉的替代資源顯得尤為緊迫。本研究通過(guò)高效液相色譜篩選到富含松果菊苷的藥源植物紅花釣鐘柳PENSTEMONBARBATUSCANROTH，利用高速逆流色譜快速分離制備松果菊苷純品用于波譜學(xué)鑒定。為了提高次生代謝產(chǎn)物松果菊苷的含量，利用分子生物學(xué)方法，在其生物合成的基因工程領(lǐng)域開(kāi)展了探索性研究。獲得的主要結(jié)果如下1首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳中含有松果菊苷，并測(cè)定了根和葉中含量的年變化。通過(guò)篩選首次發(fā)現(xiàn)紅花釣鐘柳含有松果菊苷，其根和葉中松果菊苷的含量隨季節(jié)變化，在一年中，最高含量分別在十一月和五月達(dá)到725±036MGG和909±032MGG。結(jié)果表明，紅花釣鐘柳中松果菊苷的含量十分接近管花肉蓯蓉中松果菊苷的含量水平，其有可能替代管花肉蓯蓉，而用于規(guī)模化生產(chǎn)松果菊苷。2利用循環(huán)高速逆流色譜等技術(shù)從紅花釣鐘柳根中得到含量為963％的松果菊苷純品420MG，并確定其結(jié)構(gòu)。從紅花釣鐘柳中分離得到松果菊苷純品。利用50％甲醇超聲提取20G紅花釣鐘柳根的粉末，所得到的甲醇提取物經(jīng)AB8樹(shù)脂預(yù)純化后，以正丁醇甲醇11，VV為溶劑系統(tǒng)，通過(guò)經(jīng)典高速逆流色譜和循環(huán)高速逆流色譜純化。最終獲得了純度為963％的松果菊苷420MG。循環(huán)HSCCC的回收率為910％。獲得的松果菊苷純品由IR1HNMR13CNMR進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確認(rèn)。3完成了狹葉松果菊中3脫氫奎尼酸合成酶基因AROB的克隆及其組織表達(dá)特征研究。以狹葉松果菊ECHINACEAANGUSTIFOLIADC組培苗為材料，用TRIZOL法提取總RNA，根據(jù)已有的3脫氫奎尼酸合成酶基因AROB保守氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)RTPCR擴(kuò)增得到1條289BP的AROB基因同源片段。利用該已知中間序列，通過(guò)快速擴(kuò)增CDNA末端技術(shù)RACE及序列拼接最終得到該基因CDNA序列，命名為EANAROB，GENBANK登錄號(hào)為EU293857。分析結(jié)果表明，EANAROBCDNA長(zhǎng)1424BP，包含一個(gè)1326BP的開(kāi)放讀碼框，氨基酸序列同源分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EANAROB編碼的氨基酸序列與番茄、葡萄、擬南芥、山毛櫸的AROB同源性都在80％左右，表明AROB氨基酸序列具有較強(qiáng)的保守性。半定量RTPCR結(jié)果表明，狹葉松果菊EANAROB基因在狹葉松果菊的根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但花和葉中的表達(dá)量較高，在根和莖中較少。4構(gòu)建了PCAMBIA2301GEAC4H1高效植物表達(dá)載體并獲得基因工程農(nóng)桿菌對(duì)含有源于狹葉松果菊的EAC4H1GENBANK登錄號(hào)為EU676019的PMD18T和中間表達(dá)載體PCAMBIA2301G分別進(jìn)行SACⅠ和XBAⅠ雙酶切。由于EAC4H1基因內(nèi)含有SACⅠ酶切位點(diǎn)，經(jīng)不完全酶切產(chǎn)生4條電泳條帶，回收1602BP的目的基因條帶和約12KB的PCAMBIA2301G載體骨架條帶。將回收的PCAMBIA2301G載體骨架與酶切后產(chǎn)生的EAC4H1目的基因片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5Α。抽提質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。經(jīng)PCR驗(yàn)證，獲得與目的基因大小一致的條帶。結(jié)果表明工程農(nóng)桿菌LBA4404PCAMBIA2301GEAC4H1已構(gòu)建成功。上述工程菌可用于遺傳轉(zhuǎn)化狹葉松果菊或紅花釣鐘柳，對(duì)在分子遺傳學(xué)水平上探討CAH在咖啡酸衍生物生物合成中的作用機(jī)理，并為進(jìn)一步獲得富含松果菊苷的轉(zhuǎn)基因狹葉松果菊和紅花釣鐘柳奠定了基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：20世紀(jì)初生物學(xué)領(lǐng)域機(jī)體論與還原論之爭(zhēng)，促成了一般系統(tǒng)論的誕生。盡管會(huì)遇到各種困難，但這的確是促進(jìn)科學(xué)統(tǒng)一的一次科學(xué)革命。科學(xué)發(fā)展過(guò)程中，在承認(rèn)機(jī)械還原論優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，更需要一個(gè)比之更完善的方法論指導(dǎo)。系統(tǒng)論思想強(qiáng)調(diào)低層次的事物和高層次的事物都需要關(guān)注，系統(tǒng)局部的變化會(huì)引起其它局部和整體的反應(yīng)，具體到生命系統(tǒng)而言，就是要既關(guān)心化學(xué)層次或分子層次上的事物，又關(guān)心較高的生命組織層次上的事物。生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)是促進(jìn)生命健康的工程學(xué)科，無(wú)論是學(xué)科基礎(chǔ)理論的發(fā)展，還是工程技術(shù)的研發(fā)，都需要從整體的角度和動(dòng)態(tài)的角度研究人體系統(tǒng)的變化規(guī)律，尤其是針對(duì)局部問(wèn)題的解決方案，需要綜合考慮與生命系統(tǒng)整體的切合性。本文根據(jù)系統(tǒng)哲學(xué)原理對(duì)生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史與方法論進(jìn)行了探討。主要包括以下四部分內(nèi)容一、生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史概述。生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)的快速發(fā)展始于20世紀(jì)50年代，“生命”和“工程”是生物醫(yī)學(xué)工程的兩個(gè)核心要素。這里的生命，包括生命個(gè)體的健康和生命群體的延續(xù)，而這也一直是其使命之源。工程則包括個(gè)體生命的健康問(wèn)題工程和群體生命的公平公正工程。相伴醫(yī)學(xué)的發(fā)展，通過(guò)解決生命系統(tǒng)健康問(wèn)題成就健康的個(gè)體生命通過(guò)促進(jìn)診斷治療的簡(jiǎn)便化和低成本化，成就健康的群體生命。本文根據(jù)系統(tǒng)哲學(xué)的事物發(fā)展演化的基本規(guī)律重新審視生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)的概念和特點(diǎn)，并在分析生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)發(fā)展概況的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了解決特殊問(wèn)題和局部問(wèn)題時(shí)遇到的困境，而這些很多已被證實(shí)是由于對(duì)系統(tǒng)整體涌現(xiàn)產(chǎn)生的新特性和功能認(rèn)識(shí)的缺失所致。二、科學(xué)技術(shù)發(fā)展演化的系統(tǒng)哲學(xué)方法論探討?；诙喾N視角，人類(lèi)在審視自己的同時(shí)，不斷嘗試著解讀大自然。人們不斷發(fā)現(xiàn)或創(chuàng)造事物之間的多種聯(lián)系方式，試圖追問(wèn)自然。而我們?cè)趻呙柽@些解讀自然和追問(wèn)自然的過(guò)程、方式、內(nèi)容和結(jié)果時(shí)，亦在試著描述系統(tǒng)的物質(zhì)、能量和信息的交換及其方式，并極力探索其要素、結(jié)構(gòu)和功能的變化。本文試圖從事物發(fā)展所遵循的系統(tǒng)哲學(xué)的差異協(xié)同律、層次轉(zhuǎn)化律和整體優(yōu)化律角度，對(duì)科學(xué)技術(shù)這一復(fù)雜系統(tǒng)演化的實(shí)質(zhì)、動(dòng)力、形式、過(guò)程進(jìn)行探討。多元性、差異性、相關(guān)性、整體性是這個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)的特點(diǎn)，差異是促成這個(gè)系統(tǒng)的發(fā)展動(dòng)力，協(xié)同則在差異基礎(chǔ)上成就了系統(tǒng)的整個(gè)發(fā)展歷程，自組織涌現(xiàn)表達(dá)了系統(tǒng)發(fā)展演化的形式，層級(jí)轉(zhuǎn)化和整體優(yōu)化則表達(dá)了科學(xué)技術(shù)系統(tǒng)的發(fā)展過(guò)程。三、人體組織器官的協(xié)同優(yōu)化及自組織行為分析。開(kāi)放性、多元性、層次性、相關(guān)性、動(dòng)態(tài)性、整體性充分表達(dá)了人體系統(tǒng)的特點(diǎn)，協(xié)同優(yōu)化和自組織行為是其典型的系統(tǒng)行為。本文對(duì)骨骼結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)歷程進(jìn)行了簡(jiǎn)單梳理，并進(jìn)行了骨的協(xié)同優(yōu)化及其自組織行為分析，提出開(kāi)放與非平衡是骨力學(xué)自組織行為的前提條件，差異信息是骨力學(xué)自組織行為的源動(dòng)力。骨的功能適應(yīng)性原理充分證實(shí)了骨的協(xié)同優(yōu)化及自組織行為。四、生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史研究的方法論探討。生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題訴求，研究過(guò)程的實(shí)踐介入，研究方法的實(shí)證性表達(dá)了生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史研究的實(shí)證性原則問(wèn)題生成的生態(tài)環(huán)境，交叉學(xué)科的整體關(guān)照，影響因子的綜合考量表達(dá)了生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史研究的整體性原則研究基礎(chǔ)的歷史性積淀，研究過(guò)程的歷史性考察，研究體系的歷史性結(jié)合表達(dá)了生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史研究的歷史性原則尊重生命的歷史軌跡，聚焦人體系統(tǒng)的歷史軌跡，人與外界的作用軌跡表達(dá)了生物醫(yī)學(xué)工程發(fā)展史研究的生命適切性原則傳統(tǒng)分析方法的不足使其隱匿，系統(tǒng)分析方法以全新的活力面對(duì)生命系統(tǒng)，系統(tǒng)分析方法本就是表達(dá)系統(tǒng)自組織演化方式的一種方法。本文把人體視為一個(gè)復(fù)雜的巨系統(tǒng)，研究其運(yùn)行中會(huì)產(chǎn)生諸多只因系統(tǒng)整體的存在而涌現(xiàn)出的新的特性、結(jié)構(gòu)和功能，這些新生事物是系統(tǒng)各部分不能產(chǎn)生的，也是系統(tǒng)各部分簡(jiǎn)單疊加后不能產(chǎn)生的，只有在各部分因某種需要和某些聯(lián)系形成“牽一發(fā)而動(dòng)全身”的有機(jī)整體方可產(chǎn)生。必須在系統(tǒng)論指導(dǎo)下審視人體生命系統(tǒng)的特性、結(jié)構(gòu)和功能，并運(yùn)用強(qiáng)調(diào)整體和動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)方法論，指導(dǎo)生物醫(yī)學(xué)工程研究（這也是生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)學(xué)科本身性質(zhì)使然），進(jìn)而回答生命個(gè)體或群體的健康問(wèn)題。

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簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)UDC密級(jí)學(xué)位論文基于逆向工程的牙種植體連接系統(tǒng)生物力學(xué)分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究作者姓名指導(dǎo)教師申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別學(xué)科專業(yè)名稱論文提交日期學(xué)位授予日期評(píng)閱人張浩良藺增副教授東北大學(xué)機(jī)械工程與自動(dòng)化學(xué)院碩士學(xué)科類(lèi)別專業(yè)學(xué)位機(jī)械工程2014年6月趣寥億論文答辯日期2014年6月答辯委員會(huì)主席京鋒J勾J東北大學(xué)獨(dú)創(chuàng)II’生聲明本人聲明，所呈交的學(xué)位論文是在導(dǎo)師的指導(dǎo)下由本人獨(dú)立完成的。論文中取得的研究成果除加以標(biāo)注和致謝的地方外，不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包括本人為獲得其他學(xué)位而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名日期學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者和指導(dǎo)教師完全了解東北大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定即學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人同意東北大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索、交流。作者和導(dǎo)師同意網(wǎng)上交流的時(shí)間為作者獲得學(xué)位后半年口學(xué)位論文作者簽字日期礪知商兩象吼兩名期簽日幣IYT一導(dǎo)整

簡(jiǎn)介：研究背景及目的輸尿管損傷后常常導(dǎo)致輸尿管缺損或狹窄，繼發(fā)患側(cè)尿路梗阻、感染、尿外滲、尿性囊腫等并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅患者的健康及生活質(zhì)量。對(duì)于損傷程度較重、缺損段較長(zhǎng)的損傷，臨床上常以胃腸道替代輸尿管的方法處理。然而，腸代輸尿管后常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生，如尿路結(jié)石，慢性感染，腸粘連等。有研究者嘗試使用人工合成材料或者異體移植的方法進(jìn)行處理，但是治療效果均不滿意。因此，輸尿管損傷后缺損的治療已經(jīng)成為泌尿外科的亟待解決的問(wèn)題之一。組織工程科學(xué)的發(fā)展為輸尿管損傷及缺損的修復(fù)重建提供了新的途徑。組織工程的方法進(jìn)行輸尿管重建必須解決兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題支架材料及種子細(xì)胞。本研究以人脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞，以聚乳酸／膠原為基本材料制作一種新型輸尿管支架材料，擬為輸尿管組織工程重建提供一種新的可行的治療方法。研究的主要目的為L(zhǎng)、探索人脂肪干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定的方法，為以脂肪干細(xì)胞為種子細(xì)胞的研究提供實(shí)踐基礎(chǔ)2、探索人脂肪干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為尿路上皮的可行性；為輸尿管組織工程研究提供新的種子細(xì)胞來(lái)源3、制作一種新型組織工程輸尿管支架，并評(píng)估這種新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖4、將攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架置入裸鼠體內(nèi)，評(píng)價(jià)材料的生物相容性，觀察支架材料內(nèi)細(xì)胞存活狀態(tài)、誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞表型能否保持，以初步評(píng)估利用這種新型輸尿管支架材料進(jìn)行組織工程輸尿管的可行性。方法1取吸脂術(shù)患者皮下脂肪組織，采用酶消化法分離人脂肪干細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)的方法鑒定其表型特征，通過(guò)成脂、成骨誘導(dǎo)初步鑒定其分化潛能。2通過(guò)TRANSWELL間接共培養(yǎng)法進(jìn)行脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，采用RTPCR、WESTERNBLOT、免疫熒光的方法對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行尿路上皮標(biāo)志物的CK18，UP2表達(dá)鑒定。3以聚乳酸及I型膠原作為基本原料，采用溶劑揮發(fā)法及電紡絲方法制作一種新型生物可降解輸尿管支架材料，將脂肪干細(xì)胞與支架材料進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)，通過(guò)電鏡、LIVEDEAD、HE染色、MTT等方法評(píng)估新型輸尿管支架是否利于人脂肪干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖。4將攜帶人脂肪干細(xì)胞的新型輸尿管支架材料植入裸小鼠（4周齡雌性）背部皮下，生長(zhǎng)14天后取材，進(jìn)行細(xì)胞徑際分析、HE染色、尿路上皮標(biāo)志物的免疫熒光鑒定。結(jié)果1采用酶消化法分離的脂肪干細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)呈貼壁生長(zhǎng)，倒置光學(xué)顯微鏡下觀察呈長(zhǎng)梭形，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表明，細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物（CD29，CD44，CD90以及CD105），不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD31及組織相容性抗原標(biāo)志HLADR。成脂誘導(dǎo)14天后細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量脂滴，并且油紅O染色呈陽(yáng)性；成骨誘導(dǎo)21天后，茜素紅染色后觀察可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)形成。2通過(guò)與尿路上皮的間接共培養(yǎng)7天后，誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)尿路上皮細(xì)胞樣，培養(yǎng)14天后，RTPCR及WESTERNBLOT可檢測(cè)到尿路上皮標(biāo)志物CK18、UP2在基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平上調(diào)。免疫熒光檢測(cè)表明，40％50的誘導(dǎo)后的干細(xì)胞表達(dá)尿路上皮標(biāo)志物（CK18及UP2）。3電鏡觀察聚乳酸／I型膠原輸尿管支架材料的表面具有三維空間結(jié)構(gòu)，材料由直徑約3微米344±094ΜM的纖維構(gòu)成，纖維間形成孔徑約10微米1054±318ΜM的孔隙。細(xì)胞支架體外孵育培養(yǎng)后3天，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)支架材料表面細(xì)胞呈鋪展?fàn)顟B(tài)，均勻分布于支架表面；MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞種植在支架后第L，3，5，7天進(jìn)行連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)攜帶膠原的支架材料細(xì)胞呈現(xiàn)持續(xù)增殖的趨勢(shì)；細(xì)胞種植7天后HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均勻分布于支架材料表面，部分細(xì)胞浸潤(rùn)生長(zhǎng)進(jìn)入材料的內(nèi)部；LIVEDEAD檢測(cè)發(fā)現(xiàn)材料上生長(zhǎng)的細(xì)胞90以上為活細(xì)胞。4所有16只動(dòng)物在攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架材料植入體內(nèi)14天的實(shí)驗(yàn)期間均安全存活，傷口愈合良好，無(wú)感染、炎癥反應(yīng)發(fā)生，誘導(dǎo)后的人脂肪干細(xì)胞能夠在裸鼠體內(nèi)存活達(dá)14天，浸潤(rùn)入支架材料的內(nèi)部，并能夠表達(dá)尿路上皮的標(biāo)志物。結(jié)論1、采用酶消化法提取人脂肪干細(xì)胞是可行的，提取的細(xì)胞能夠表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，具有良好的增殖及分化潛能。2、采用間接共培養(yǎng)法能夠誘導(dǎo)人脂肪干細(xì)胞向尿路上皮細(xì)胞分化，誘導(dǎo)分化后的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并且可表達(dá)尿路上皮的標(biāo)志物。3、采用聚乳酸／I型膠原材料制作的新型輸尿管支架材料，能夠適合人脂肪干細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖。4、體內(nèi)植入實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶細(xì)胞的新型輸尿管支架材料具有良好的生物學(xué)性能，誘導(dǎo)分化后的人脂肪干細(xì)胞在隨支架植入體內(nèi)后能夠存活、生長(zhǎng)并保持其分化特征。本研究為輸尿管組織工程重建提供了新的有希望的治療方案。

簡(jiǎn)介：本文采用酶消化法獲取的豬頸總動(dòng)脈脫細(xì)胞基質(zhì)作為組織工程血管支架，采用組織貼塊法培養(yǎng)幼年家犬胸主動(dòng)脈VSMC，膠原酶消化法培養(yǎng)EC，傳代純化，獲得了足夠數(shù)量、高純度的家犬VSMC和EC種子細(xì)胞，將VSMC種植在制備好的脫細(xì)胞支架上進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)其形態(tài)結(jié)構(gòu)、生物力學(xué)特性和血管壁細(xì)胞的功能進(jìn)行研究，以獲得能應(yīng)用于臨床的理想的血管替代物、為血管組織工程的的發(fā)展提供有意義的資料。研究結(jié)果表明，本文研制的血管自動(dòng)旋轉(zhuǎn)種植培養(yǎng)系統(tǒng)有利于種子細(xì)胞在支架腔面及管壁內(nèi)均勻生長(zhǎng)；本文構(gòu)建的組織工程血管其最大斷裂強(qiáng)度、粘彈性等生物力學(xué)特性指標(biāo)，都接近生理血管，提示具有較理想的生物力學(xué)特性；VSMC與EC在脫細(xì)胞支架上生長(zhǎng)良好，具有一定的生理功能，兩者相互影響，并參與了血管重建。

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簡(jiǎn)介：組織工程學(xué)是一門(mén)跨學(xué)科的新領(lǐng)域，旨在應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理建造能夠用于重建、維持或提高缺損組織功能的生物性人體組織。近年來(lái)，隨著細(xì)胞支架材料的不斷發(fā)展和組織構(gòu)建技術(shù)的日趨成熟，國(guó)內(nèi)、外的科研人員已經(jīng)成功地在動(dòng)物體內(nèi)培育出組織工程化人工軟骨。在美國(guó)，一種組織工程化人工軟骨產(chǎn)品已經(jīng)通過(guò)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床。國(guó)內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨組織工程研究近年來(lái)也已經(jīng)取得突破性進(jìn)展，有望近年內(nèi)開(kāi)發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的組織工程化人工軟骨產(chǎn)品。關(guān)節(jié)軟骨具有重要的生理功能，但損傷后自身修復(fù)能力有限。幾十年來(lái)，科學(xué)家和外科醫(yī)生們一直致力于軟骨缺損的修復(fù)研究，但進(jìn)展緩慢。由于軟骨組織具有能夠保持移植活力、吸收少等優(yōu)點(diǎn)，在臨床上獲得廣泛應(yīng)用，但在應(yīng)用過(guò)程中供體材料來(lái)源有限，需二次手術(shù)，而且自體肋軟骨移植還有遠(yuǎn)期鈣化傾向；同種異體及異種軟骨移植物都不同程度地存在自溶現(xiàn)象，還會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)甚至傳播病原?；谝陨线@種現(xiàn)實(shí)情況，嘗試新的技術(shù)和手段進(jìn)行軟骨缺損治療迫在眉睫。組織工程研究為修復(fù)因各種原因?qū)е碌年P(guān)節(jié)軟骨缺損帶來(lái)了希望。近年來(lái)軟骨組織工程的進(jìn)展并不順利，主要是因?yàn)槿狈硐氲姆N子細(xì)胞和適宜的支架材料。在種子細(xì)胞方面，自體軟骨細(xì)胞來(lái)源有限，異體或異種軟骨細(xì)胞又往往會(huì)出現(xiàn)自溶和免疫排斥。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLS，MSCS是一類(lèi)具有多向分化潛能的組織干細(xì)胞，在體外特定的誘導(dǎo)條件下可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉、神經(jīng)、肌腱、韌帶等多種組織。該細(xì)胞群來(lái)源易得，取材方便，增殖能力強(qiáng)，可在體外大規(guī)模擴(kuò)增而不丟失多分化潛能，并且異體移植時(shí)排斥反應(yīng)小，因此是軟骨組織工程種子細(xì)胞的潛在來(lái)源。在支架材料方面，以往研究中多采用聚合物、膠原等材料，而這些材料均不同程度地存在生物相容性差、機(jī)械強(qiáng)度不足等問(wèn)題。近年來(lái)法國(guó)地中海大學(xué)成功地研制了微孔結(jié)構(gòu)可控的ΒTCP多孔陶瓷材料，該材料不僅具有良好的生物相容性和較高的機(jī)械強(qiáng)度，而且能夠根據(jù)需要調(diào)節(jié)材料在體內(nèi)的降解時(shí)間。這些特性表明，該材料是非常有潛力的一類(lèi)組織工程細(xì)胞支架材料。目前國(guó)內(nèi)外以ΒTCP陶瓷作為植骨材料的研究報(bào)道較多，但尚未見(jiàn)將其作為細(xì)胞支架材料的研究報(bào)道。本研究探討了以ΒTCP為支架材料，以MSC為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化生物型人工軟骨，修復(fù)大動(dòng)物關(guān)節(jié)軟骨缺損的可行性，從而為關(guān)節(jié)軟骨組織工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展開(kāi)辟道路。本研究共分兩部分。第一部分進(jìn)行了軟骨組織工程種子細(xì)胞的研究。采用密度梯度離心法分離純化了人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了表型鑒定和生物學(xué)活性分析，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了向軟骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。結(jié)果表明，采用密度為1073GML的PERCOL密度梯度離心法可以有效分離MSC，細(xì)胞具有未分化細(xì)胞的表型，純度大于97％。組織化學(xué)染色和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定顯示，獲得的細(xì)胞具有MSC的生物學(xué)特征。體外誘導(dǎo)分化表明該細(xì)胞可向軟骨細(xì)胞分化。第二部分進(jìn)行了組織工程化軟骨的體外構(gòu)建和體內(nèi)應(yīng)用研究。將軟骨細(xì)胞接種到支架材料上，進(jìn)行體外培育，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞可以順利爬入材料的孔洞內(nèi)和孔洞間，貼附增殖并分泌細(xì)胞外基質(zhì)，顯示材料良好的生物相容性。將構(gòu)建的MSCΒTCP復(fù)合體植入體內(nèi)修復(fù)羊關(guān)節(jié)軟骨缺損，顯示3個(gè)月時(shí)關(guān)節(jié)軟骨得到明顯修復(fù)，6個(gè)月時(shí)缺損區(qū)基本被新生軟骨組織所替代。綜合以上結(jié)果，本研究表明，MSC可以作為軟骨組織工程的種子細(xì)胞，其在體內(nèi)環(huán)境的誘導(dǎo)下可以形成軟骨組織；ΒTCP是軟骨組織工程一種較為理想的支架材料，以其為支架，以MSC為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程化生物性人工軟骨具有臨床應(yīng)用潛力和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)前景。

簡(jiǎn)介：人工瓣膜置換術(shù)是目前世界上治療心臟瓣膜疾病的主要常規(guī)方法，人工瓣膜包括機(jī)械瓣和生物瓣兩大類(lèi)。它的發(fā)明挽救了大部分瓣膜病患者生命，并提高了其生存質(zhì)量。但是都未達(dá)到理想程度，比如機(jī)械瓣需要終生抗凝，并且存在潛在性的出血、血栓形成和瓣體脫落引起栓塞的危險(xiǎn)；生物瓣耐久性不足，易鈣化、變性、衰敗、穿孔而失去功能。最重要的是人工瓣膜不具有再生長(zhǎng)的性能，特別是主要應(yīng)用于兒童的同種管道等等，因而在兒童病人的應(yīng)用中受到極大的限制12目前只有自體管道如ROSS手術(shù)中將自體肺動(dòng)脈移植到主動(dòng)脈位置，才能保持瓣膜和管道的繼續(xù)生長(zhǎng)3但是ROSS手術(shù)要求技術(shù)難度高，風(fēng)險(xiǎn)大并且也只能適用于很少的一部分兒童病人，而且尚存在一些不確定因素例如管道是否確切地能擔(dān)負(fù)起同步生長(zhǎng)而完全適應(yīng)其未來(lái)的生理需要呢4所以尋找一種更加完善的瓣膜替代物，研發(fā)組織工程心臟瓣膜是其中一項(xiàng)具有廣闊前景的方法并且已經(jīng)取得了可喜進(jìn)展。組織工程學(xué)就是應(yīng)用生物學(xué)和工程學(xué)的原理來(lái)發(fā)展一種可替代的組織，代表了一種新興的科學(xué)概念，在體外制造出有活性細(xì)胞的間質(zhì)組織并具有抗血栓的表面，從而擁有自我修復(fù)和再塑形的能力，從而克服上述缺陷。截止目前，世界上已經(jīng)有組織工程皮膚和組織工程膀胱研制成功的報(bào)道?，F(xiàn)行組織工程的研究?jī)?nèi)容有三個(gè)關(guān)鍵部分，種子細(xì)胞選擇、支架材料選取和復(fù)合技術(shù)的改進(jìn)。早期，大多數(shù)組織工程瓣膜實(shí)驗(yàn)研究中多采用血管來(lái)源細(xì)胞，從而不可避免地具有一定缺陷，如細(xì)胞的收集必須要犧牲供體完整的血管結(jié)構(gòu)，并且因其細(xì)胞特性不同于瓣膜間質(zhì)細(xì)胞，可能影響組織工程瓣膜的功能。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELLSBMSCS）可由受體骨髓采集，在體外分離和擴(kuò)增而獲得，并且可定向分化成各種細(xì)胞，包括骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌細(xì)胞等等，亦有報(bào)道稱有向內(nèi)皮細(xì)胞方向分化者。本課題選擇羊BMSCS作為種子細(xì)胞，因?yàn)槠湟子谕ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的骨髓穿刺而獲取，可以避免增加副損傷；BMSCS具有多向分化潛能、且能貼附在異體支架材料上生長(zhǎng)擴(kuò)增，在一定的微環(huán)境下有向瓣膜間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分化的可能性。支架材料仍采用本中心研究的去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架作為組織工程心臟瓣膜支架、并著重引進(jìn)PEG水凝膠技術(shù)，改進(jìn)細(xì)胞與材料支架的復(fù)合方法，進(jìn)行體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜；然后植入細(xì)胞供體羊的腹主動(dòng)脈內(nèi)進(jìn)行觀察，避免免疫排斥反應(yīng)的干擾，觀察體內(nèi)微環(huán)境對(duì)組織形成和細(xì)胞分化的影響。對(duì)組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建進(jìn)行進(jìn)一步的研究與探索。第一部分分離、純化、擴(kuò)增并鑒定羊BMSCS細(xì)胞經(jīng)PERCOLL密度梯度離心和貼壁生長(zhǎng)的方法從采集的羊骨髓液中提取，通過(guò)倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過(guò)免疫組化及定向分化來(lái)進(jìn)行鑒定。結(jié)果羊BMSCS免疫組化染色顯示SH2VIMENTIN均呈陽(yáng)性表達(dá)。CD34和VIII因子相關(guān)抗原的表達(dá)均為陰性。經(jīng)向脂肪細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后，油紅O染色顯現(xiàn)明顯的胞內(nèi)脂滴。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來(lái)的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，具有多向分化潛能，而且細(xì)胞數(shù)量和活性滿意10～15ML羊的骨髓在20D左右經(jīng)4～6代培養(yǎng)后即可達(dá)到652±024107細(xì)胞數(shù)量級(jí)，能滿足組織工程種子細(xì)胞的需求。；第二部分去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣和改性PEG水凝膠的制備采用滲透壓和TRITONX100結(jié)合的辦法制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣膜支架，并且進(jìn)行PEG水凝膠的改性，結(jié)合RGD、TGFΒ1和VEGF，將BMSCS靜態(tài)種植于其上進(jìn)行培養(yǎng)，并對(duì)種植細(xì)胞的效果進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。結(jié)果應(yīng)用組織切片HE染色和掃描電鏡的方法證實(shí)BMSCS細(xì)胞的生物相容性較好，PEG水凝膠可以混勻細(xì)胞，并將細(xì)胞緊密結(jié)合到去細(xì)胞生物支架上PEGTEHV組的細(xì)胞貼附率明顯高于NONPEG組2592±0005VS1885±0004；摸索出有效貼附到瓣膜上的細(xì)胞接種方法，可提高種子細(xì)胞的貼壁率和有效分布，為下一步體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)；第三部分體內(nèi)腹主動(dòng)脈移植實(shí)驗(yàn)以去細(xì)胞豬主動(dòng)脈單瓣為支架、自體BMSCS為種子細(xì)胞包裹于改性PEG水凝膠完成細(xì)胞與支架的復(fù)合過(guò)程，當(dāng)單葉的組織工程瓣膜種植進(jìn)細(xì)胞供體羊的腹主動(dòng)脈內(nèi)，我們進(jìn)行BMSCS種子細(xì)胞的體內(nèi)分化趨勢(shì)的觀察。組織工程心臟瓣膜PEGTEHV作為A組；種植BMSCS細(xì)胞但無(wú)PEG包被處理作為B組；山羊自身主動(dòng)脈瓣膜設(shè)為C組為對(duì)照。分別于術(shù)后第16周后取材進(jìn)行形態(tài)、組織學(xué)、掃描和透射電鏡觀察以及生物力學(xué)檢測(cè)。分析BMSCS細(xì)胞在體內(nèi)的分化方向及比較三組之間的異同。結(jié)果A組張力強(qiáng)度、內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋率明顯優(yōu)于B組085±002014±001；其中A組B組附壁血栓形成率為0100％；A組生物力學(xué)強(qiáng)度接近羊自身主動(dòng)脈瓣膜；并且骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞于體內(nèi)微環(huán)境下向內(nèi)皮細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞等細(xì)胞分化。利用改性聚乙二醇（PEG）水凝膠復(fù)合去細(xì)胞生物支架材料以及自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程瓣膜具有可行性。

簡(jiǎn)介：背景游離脂肪組織移植是臨床上具有廣泛用途的一種方法，但因移植后的脂肪組織吸收率高、造成供區(qū)繼發(fā)畸形等缺點(diǎn)而受到限制。組織工程技術(shù)的發(fā)展為脂肪組織移植指明了前景。目前已證實(shí)脂肪組織來(lái)源的干細(xì)胞（S）具有體內(nèi)外多向分化潛能，但目前所能獲得的S是位于人脂肪組織內(nèi)的一個(gè)混雜細(xì)胞群體，只有大約40的細(xì)胞能向脂肪細(xì)胞分化。因此，S并不能完全滿足脂肪組織工程的發(fā)展需要，尋找一種增殖能力強(qiáng)、成脂分化率高、易于分離的更理想的種子細(xì)胞仍然是研究熱點(diǎn)。脂肪組織內(nèi)除了含有上述的干細(xì)胞外，其主要成分是成熟脂肪細(xì)胞，脂肪細(xì)胞因大量的脂質(zhì)聚集而具有漂浮性，難以體外培養(yǎng)。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為脂肪細(xì)胞是處于分化終末階段，缺乏增殖能力的一種細(xì)胞。然而，國(guó)外有研究表明，成熟脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)的過(guò)程中，能發(fā)生脂質(zhì)分解變化，重新啟動(dòng)增殖機(jī)制并分裂增殖。這種生理轉(zhuǎn)變被稱為脂肪細(xì)胞去分化，由去分化得到的細(xì)胞被稱為去分化脂肪細(xì)胞（DA）。廖云君等的研究證實(shí)DA在體外定向誘導(dǎo)培養(yǎng)下具有向成脂、成骨、成軟骨分化等多向分化能力，且較之S有更高的成脂能力。因此，DA有可能成為脂肪組織工程更具前景的種子細(xì)胞來(lái)源。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)如何高效提純成熟脂肪細(xì)胞并獲取DA、DA的多向分化潛能的研究還很少，尚未見(jiàn)應(yīng)用DA作為種子細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)行組織工程化脂肪組織的構(gòu)建。本研究將針對(duì)上述問(wèn)題進(jìn)行探討。目的1通過(guò)從人脂肪抽吸物的脂質(zhì)部分分離、提純成熟脂肪細(xì)胞，并進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究脂肪細(xì)胞去分化現(xiàn)象，探討脂肪細(xì)胞去分化的原理和方法。2通過(guò)對(duì)DA的形態(tài)觀察和定向誘導(dǎo)，探討DA的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和多向分化潛能。3通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，將DA與FG可注射性支架混合后注射于裸鼠皮下試構(gòu)建組織工程化脂肪，探討DA作為脂肪組織工程種子細(xì)胞的可行性和潛力。方法從成人吸脂術(shù)后的抽吸物提取成熟脂肪細(xì)胞及S，天花板貼壁培養(yǎng)法使成熟脂肪細(xì)胞去分化，觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并獲得DA。油紅“O”染色、阿爾辛藍(lán)染色、茜素紅染色分別鑒定DA成脂分化、成軟骨、成骨分化分化結(jié)果；光鏡及掃描電鏡檢測(cè)DA及S與FG支架的相容性；將DIⅠ熒光染料標(biāo)記過(guò)的DAFG混合物（A組，N8，細(xì)胞量410S）和SFG混合物（B組，N8，細(xì)胞量4106）以及空白FG支架（C組，N8）注射于裸鼠皮下。8周后將新生組織取出，給予大體觀察和濕重測(cè)定，HE染色、H染色和油紅“O”染色后進(jìn)行組織學(xué)觀察、纖維化比率定量測(cè)定和熒光顯微鏡觀察以鑒定新生物的性質(zhì)、來(lái)源。結(jié)果人成熟脂肪細(xì)胞在天花板貼壁法培養(yǎng)下能去分化為成纖維細(xì)胞狀細(xì)胞，經(jīng)過(guò)多向分化誘導(dǎo)檢測(cè)證實(shí)該細(xì)胞為DA。成脂分化兩周，油紅“O”染色可見(jiàn)DA內(nèi)出現(xiàn)紅色脂滴；成軟骨分化兩周，阿爾辛藍(lán)染色可見(jiàn)DA內(nèi)軟骨基質(zhì)沉積成骨分化三周，茜素紅染色可見(jiàn)DA內(nèi)出現(xiàn)紅色鈣鹽沉積。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中A組和B組8周后在裸鼠背部皮下均有新生組織塊形成，濕重的X±S分別為01249±00190（G）和00971±00166（G）（F12350，P001）。纖維化比率的X±S分別為1420±2625和2589±5314（F34678，P0001）。C組未見(jiàn)新生組織形成，支架被完全吸收。新生組織經(jīng)檢測(cè)后證實(shí)其為成熟脂肪塊并來(lái)源于植入的種子細(xì)胞。結(jié)論1從成人脂肪抽吸物脂質(zhì)部分中可以分離、提純得到大量的成熟脂肪細(xì)胞。2成熟的脂肪細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下可去分化為DA，DA呈成纖維細(xì)胞狀，增殖活性強(qiáng)，并具有多向分化能力。3DA與FG支架混合后注射于裸鼠皮下能初步形成組織工程化脂肪；較之S，DA構(gòu)建出的脂肪塊具有濕重大，纖維化比率低等優(yōu)點(diǎn)。DA是脂肪組織工程理想的種子細(xì)胞。

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