改性PEG水凝膠—去細胞生物復合支架材料構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實驗研究.pdf

1、人工瓣膜置換術是目前世界上治療心臟瓣膜疾病的主要常規(guī)方法，人工瓣膜包括機械瓣和生物瓣兩大類。它的發(fā)明挽救了大部分瓣膜病患者生命，并提高了其生存質(zhì)量。但是都未達到理想程度，比如機械瓣需要終生抗凝，并且存在潛在性的出血、血栓形成和瓣體脫落引起栓塞的危險；生物瓣耐久性不足，易鈣化、變性、衰敗、穿孔而失去功能。最重要的是人工瓣膜不具有再生長的性能，特別是主要應用于兒童的同種管道等等，因而在兒童病人的應用中受到極大的限制[1,2],目前只有自體管

2、道如Ross手術中將自體肺動脈移植到主動脈位置，才能保持瓣膜和管道的繼續(xù)生長[3],但是Ross手術要求技術難度高，風險大并且也只能適用于很少的一部分兒童病人，而且尚存在一些不確定因素—例如管道是否確切地能擔負起同步生長而完全適應其未來的生理需要呢[4]？所以尋找一種更加完善的瓣膜替代物，研發(fā)組織工程心臟瓣膜是其中一項具有廣闊前景的方法并且已經(jīng)取得了可喜進展。
　　組織工程學就是應用生物學和工程學的原理來發(fā)展一種可替代的組織，代表

3、了一種新興的科學概念，在體外制造出有活性細胞的間質(zhì)組織并具有抗血栓的表面，從而擁有自我修復和再塑形的能力，從而克服上述缺陷。截止目前，世界上已經(jīng)有組織工程皮膚和組織工程膀胱研制成功的報道。
　　現(xiàn)行組織工程的研究內(nèi)容有三個關鍵部分，種子細胞選擇、支架材料選取和復合技術的改進。早期，大多數(shù)組織工程瓣膜實驗研究中多采用血管來源細胞，從而不可避免地具有一定缺陷，如細胞的收集必須要犧牲供體完整的血管結(jié)構(gòu)，并且因其細胞特性不同于瓣膜間質(zhì)細胞

4、，可能影響組織工程瓣膜的功能。骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BMSCs）可由受體骨髓采集，在體外分離和擴增而獲得，并且可定向分化成各種細胞，包括骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和肌細胞等等，亦有報道稱有向內(nèi)皮細胞方向分化者。本課題選擇羊BMSCs作為種子細胞，因為其易于通過簡單的骨髓穿刺而獲取，可以避免增加副損傷；BMSCs具有多向分化潛能、且能貼附在異體支架材料上生長擴增，在一定的微環(huán)境下有

5、向瓣膜間質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞分化的可能性。支架材料仍采用本中心研究的去細胞豬主動脈瓣膜支架作為組織工程心臟瓣膜支架、并著重引進PEG水凝膠技術，改進細胞與材料支架的復合方法，進行體外構(gòu)建組織工程心臟瓣膜；然后植入細胞供體羊的腹主動脈內(nèi)進行觀察，避免免疫排斥反應的干擾，觀察體內(nèi)微環(huán)境對組織形成和細胞分化的影響。對組織工程心臟瓣膜的構(gòu)建進行進一步的研究與探索。
　　第一部分：分離、純化、擴增并鑒定羊BMSCs細胞：經(jīng)Percoll密度梯度

6、離心和貼壁生長的方法從采集的羊骨髓液中提取，通過倒置顯微鏡觀察其形態(tài)，通過免疫組化及定向分化來進行鑒定。結(jié)果：羊BMSCs免疫組化染色顯示：SH2,Vimentin均呈陽性表達。CD34和VIII因子相關抗原的表達均為陰性。經(jīng)向脂肪細胞定向誘導分化后，油紅O染色顯現(xiàn)明顯的胞內(nèi)脂滴。結(jié)果表明經(jīng)此種方法分離純化而來的細胞為骨髓間充質(zhì)干細胞，具有多向分化潛能，而且細胞數(shù)量和活性滿意：10～15ml/羊的骨髓在20d左右經(jīng)4～6代培養(yǎng)后即可達到

7、(6.52±0.24)×107細胞數(shù)量級，能滿足組織工程種子細胞的需求。；
　　第二部分：去細胞豬主動脈瓣和改性PEG水凝膠的制備：采用滲透壓和Triton-X100結(jié)合的辦法制備去細胞豬主動脈瓣膜支架，并且進行PEG水凝膠的改性，結(jié)合RGD、TGF-β1和VEGF，將BMSCs靜態(tài)種植于其上進行培養(yǎng)，并對種植細胞的效果進行初步評價。結(jié)果：應用組織切片HE染色和掃描電鏡的方法證實BMSCs細胞的生物相容性較好，PEG水凝膠可以混勻

8、細胞，并將細胞緊密結(jié)合到去細胞生物支架上[PEG-TEHV組的細胞貼附率明顯高于Non-PEG組(2.592±0.005vs1.885±0.004)]；摸索出有效貼附到瓣膜上的細胞接種方法，可提高種子細胞的貼壁率和有效分布，為下一步體內(nèi)實驗打下基礎；
　　第三部分：體內(nèi)腹主動脈移植實驗：以去細胞豬主動脈單瓣為支架、自體BMSCs為種子細胞包裹于改性PEG水凝膠完成細胞與支架的復合過程，當單葉的組織工程瓣膜種植進細胞供體羊的腹主動脈

9、內(nèi)，我們進行BMSCs種子細胞的體內(nèi)分化趨勢的觀察。組織工程心臟瓣膜(PEG-TEHV)作為A組；種植BMSCs細胞但無PEG包被處理作為B組；山羊自身主動脈瓣膜設為C組為對照。分別于術后第16周后取材進行形態(tài)、組織學、掃描和透射電鏡觀察以及生物力學檢測。分析BMSCs細胞在體內(nèi)的分化方向及比較三組之間的異同。結(jié)果：A組張力強度、內(nèi)皮細胞覆蓋率明顯優(yōu)于B組(0.85±0.02：0.14±0.01)；其中A組：B組附壁血栓形成率為0：10