復合材料體外動態(tài)構建組織工程心臟瓣膜及其鈣化機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料的構建
　　第一節(jié):PEG交聯(lián)去細胞瓣
　　目的:PEG交聯(lián)去細胞瓣構建 PEG-去細胞瓣材料。
　　方法:合成枝化狀 PEG,利用SATA法在去細胞瓣上引入巰基,通過邁克爾加成反應,構建 PEG交聯(lián)去細胞瓣材料。生物力學測試交聯(lián)對支架材料力學性能的影響。
　　結果:PEG交聯(lián)去細胞瓣構建條件溫和易控,交聯(lián)效果確切;PEG-去細

2、胞瓣材料抗拉強度明顯高于單純去細胞瓣(7.53±032 Mpa vs.5.65±0.28 Mpa,P<0.05),與天然瓣膜抗拉強度相比,差異無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。
　　結論:通過邁克爾加成反應,PEG可成功交聯(lián)去細胞瓣,構建與天然瓣膜抗拉強度相似的PEG-去細胞瓣材料。
　　第二節(jié):構建 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料
　　目的:PEG-去細胞瓣材料共價接枝 GRGDSPC肽,構建 RGD-PEG-去細胞瓣

3、復合材料。
　　方法:PEG-去細胞瓣與1ml GRGDSPC肽溶液在37℃發(fā)生邁克爾加成反應,分光光度法檢測復合材料結合 GRGDSPC肽質量,并行免疫熒光定性檢測。
　　結果:GRGDSPC肽能有效地結合于 PEG-去細胞瓣,免疫熒光法檢測證實 GRGDSPC肽與 PEG-去細胞瓣有效共價接枝。
　　結論:PEG-去細胞瓣材料能夠在體外有效地結合 GRGDSPC肽,構建 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料。
　

4、　第二部分 生物反應器系統(tǒng)的構建
　　目的:構建生物反應器系統(tǒng),并對系統(tǒng)進行流量和生物相容性測試。
　　方法：通過保定蘭格 WT600-1F蠕動泵,生物反應器流室,硅膠管道和儲液室構建生物反應器系統(tǒng)。生物反應器流室內植入 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料,測試不同流量下系統(tǒng)工作狀態(tài)及生物相容性。
　　結果：生物反應器通過蠕動泵產(chǎn)生脈動流,能夠有效模擬體內血流動力學環(huán)境。精確調控生物反應器的流量,可以對 TEHV施加不同

5、大小的剪切應力刺激。
　　結論:成功構建生物反應器系統(tǒng),通過對流量的精確調控,可以實現(xiàn)不同大小的剪切應力刺激。
　　第三部分 復合材料體外動態(tài)構建組織工程心臟瓣膜及其鈣化機制研究
　　第一節(jié)瓣膜間質細胞分離、培養(yǎng)及鑒定
　　目的:分離、培養(yǎng)、鑒定瓣膜間質細胞。
　　方法:膠原酶消化法分離瓣膜中間質細胞,在含10％FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng),通過免疫熒光對細胞進行鑒定。
　　結果:通過膠原酶消化法可成功從人主動

6、脈瓣中分離出瓣膜間質細胞。原代培養(yǎng)的瓣膜間質細胞單層生長,形態(tài)呈梭形,放射狀排列,隨數(shù)量增長相互連接成片,5-7天匯合成單層。細胞鑒定α平滑肌肌動蛋白(a-SMA)免疫熒光染色陽性,波形蛋白(vimentin)免疫熒光染色陽性。
　　結論:膠原酶消化法簡單易行,可成功分離出瓣膜中的瓣膜間質細胞。瓣膜間質細胞增殖能力強,可作為組織工程瓣膜理想的種子細胞。
　　第二節(jié) 復合材料生物反應器內構建組織工程心臟瓣膜
　　目的:R

7、GD-PEG-去細胞瓣復合材料上種植瓣膜間質細胞,生物反應器內構建組織工程心臟瓣膜。
　　方法:RGD-PEG-去細胞瓣復合材料上種植瓣膜間質細胞,生物反應器內體外動態(tài)培養(yǎng)。接細胞計數(shù)法檢測第2h、4h、8h細胞黏附情況,第10天后行形態(tài)學觀察和DNA含量測定。
　　結果:細胞黏附計數(shù)和形態(tài)學觀察提示,RGD-PEG-去細胞瓣復合材料明顯促進瓣膜間質細胞黏附,并形成連續(xù)單層細胞覆蓋。DNA含量測定提示種植細胞后RGD-PEG

8、-去細胞瓣復合材料較單純去細胞瓣組和PEG-去細胞瓣組明顯增高(25.98±2.45μg/瓣葉 vs.19.61±1.94μg/瓣葉 vs.18.40±1.89μg/瓣葉,P<0.05)。
　　結論:生物反應器內 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料,可促進種子細胞的黏附,改善瓣膜支架生物學性能。
　　第三節(jié):阻斷 Notch-1信號通路誘導組織工程心臟瓣膜鈣化
　　目的:RGD-PEG-去細胞瓣復合材料上種植瓣膜間質細胞

9、構建組織工程心臟瓣膜,阻斷 Notch-1信號通路,生物反應器內動態(tài)培養(yǎng),誘導鈣化。
　　方法:3-8代的瓣膜間質細胞培養(yǎng)基中加入γ-分泌酶抑制劑 DAPT,阻斷 Notch-1信號通路,每三至四天換液,共干預3周。種植于 RGD-PEG-去細胞瓣復合材料,生物反應器內動態(tài)培養(yǎng)10天。標準培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陰性對照組。含甘油磷酸、維生素 C、地塞米松的鈣化培養(yǎng)基培養(yǎng)作為陽性對照組。茜素紅染色觀察鈣沉積。RT-PCR檢測α-平滑肌動蛋白

10、、核心結合因子、骨鈣素等鈣化相關因子表達。Western blot法檢測核心結合因子、骨鈣素、骨橋蛋白等鈣化相關蛋白表達。
　　結果:實驗組茜素紅染色陽性。RT-PCR提示實驗組α-平滑肌動蛋白、核心結合因子、骨鈣素等表達較陰性對照組明顯升高(P<0.05)。Western blot提示實驗組核心結合因子、骨鈣素、骨橋蛋白等鈣化相關蛋白表達較陰性對照組明顯升高(P<0.05)。
　　結論:通過γ-分泌酶抑制劑 DAPT阻斷