應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞構(gòu)建組織工程瓣膜的研究.pdf

1、目的：探索建立一套可靠穩(wěn)定的體外培養(yǎng)擴(kuò)增鑒定臍血和外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)的方法，觀察比較臍血和外周血EPCs形態(tài)學(xué)及生物學(xué)特性，并探討利用EPCs進(jìn)行體外再內(nèi)皮化去細(xì)胞生物瓣膜構(gòu)建組織工程瓣膜的可行性。 方法：采用密度梯度離心法分離人臍血和外周血單個(gè)核細(xì)胞，以3×106／cm2密度接種細(xì)胞到事先包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)孔，加入含20％胎牛血清的M199培養(yǎng)液并添加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Ⅶ郇)和內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(ECGS)(終濃

2、度分別為10ng/ml及150ug/ml)。培養(yǎng)三天后，以培養(yǎng)液洗去懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞繼續(xù)原條件培養(yǎng)。分別采用流式細(xì)胞術(shù)分析培養(yǎng)細(xì)胞CD34、vE．Ca曲erin、VEGFR-2及CDl33的表達(dá)，DiI-ac-LDL吞噬試驗(yàn)、Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化以及RT—PCR觀察細(xì)胞eNOS和ET．1的表達(dá)證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞的干細(xì)胞和內(nèi)皮屬性。 倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)臍血和外周血EPCs的形態(tài)特征，比較其集落形成能力。M開(kāi)法測(cè)試臍血和外周血E

3、PCs的增殖能力，重貼壁法比較臍血和外周血EPCs的黏附能力。 采用酶一去垢劑法去除新鮮豬主動(dòng)脈瓣細(xì)胞制備去細(xì)胞瓣膜支架，采用常規(guī)組織切片HE、M弱son染色及掃描電鏡評(píng)價(jià)去細(xì)胞效果及纖維支架完整性，MTT法評(píng)價(jià)去細(xì)胞瓣膜細(xì)胞毒性。將培養(yǎng)的人外周血EPCs均勻接種到去細(xì)胞瓣膜并共孵育兩周以實(shí)現(xiàn)再內(nèi)皮化。采用常規(guī)組織切片HE染色及掃描電鏡檢查證實(shí)再內(nèi)皮化，并初步評(píng)價(jià)其生物力學(xué)特性。 結(jié)果：人臍血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)3天后，形成典

4、型EPCs樣集落，6天后流式細(xì)胞儀分析示CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例為(65．09±¨．89)％，VE．Cadherin陽(yáng)性細(xì)胞比例為(44．69±9．74)％，VEGFR-2陽(yáng)性細(xì)胞比例為(3046±9．23)％，CDl33陽(yáng)性細(xì)胞比例為(19．68±0．8D％，CD34、VE．Ca曲edn雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(41．67±10．18)％，VEGFR-2、VE．Cadherin雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(28．19±14．85)％，CD34、CDl33雙陽(yáng)

5、性細(xì)胞比例為(18．67±1．27)％，VEGFR-2、CDl33雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(15.1O±7．42)％。人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)6天后流式細(xì)胞儀分析示CD34陽(yáng)性細(xì)胞比例為(73．13±8．51)％，VE—Ca曲e血陽(yáng)性細(xì)胞比例為(62．65±10．90)％，VEGFR．2陽(yáng)性細(xì)胞比例為(7．16±131)％，CDl33陽(yáng)性細(xì)胞比例為(5．15±2．15)％，CD34、Ⅶ一Cadhedn雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(60．17±9．47)％，V

6、EGFR-2、VE．Ca曲erin雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(5．71±0．74)％，CD34、CDl33雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(3．87±0．40)％，VEGFR．2、CDl33雙陽(yáng)性細(xì)胞比例為(4．49±O．55)％。培養(yǎng)第7天示兩種來(lái)源的貼壁細(xì)胞及集落均吞噬DiI-ac-LDL，熒光顯微鏡下發(fā)紅色熒光。培養(yǎng)兩周后，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽(yáng)性，細(xì)胞胞漿呈棕黃色，盯一PCR結(jié)果示細(xì)胞表達(dá)eNOS和ET一1。長(zhǎng)程培養(yǎng)中細(xì)胞形成條索狀結(jié)構(gòu)(7～10天)及

7、典型內(nèi)皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)(16～21天)。 兩種來(lái)源的EPCs集落形成能力，增殖能力及黏附能力比較結(jié)果示：臍血來(lái)源的EPCs均強(qiáng)于外周血EPCs(P

8、色及掃描電鏡發(fā)現(xiàn)細(xì)胞緊貼瓣膜表面生長(zhǎng)形成一層連續(xù)的單細(xì)胞層，初步生物力學(xué)測(cè)定示去細(xì)胞前與再內(nèi)皮化后，瓣膜力學(xué)特性無(wú)明顯改變。 結(jié)論： 采用貼壁選擇法，可在體外成功培養(yǎng)出人臍血和外周血EPCs。綜合流式細(xì)胞術(shù)、熒光細(xì)胞化學(xué)染色、免疫組化、盯．PCR及細(xì)胞形態(tài)觀察可證實(shí)培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。 臍血EPCs增殖能力和黏附能力強(qiáng)于外周血EPCs。酶一去垢劑法能成功去除新鮮豬主動(dòng)脈瓣細(xì)胞，纖維支架結(jié)構(gòu)保存完整。利用外周血EP