脫細(xì)胞支架的新法制備及內(nèi)皮前體細(xì)胞在瓣膜組織工程中的應(yīng)用.pdf

1、目的：心臟瓣膜疾病是臨床常見病，死亡率高，瓣膜置換是治療心臟瓣膜疾病最有效的方法。然而現(xiàn)有的機(jī)械瓣和生物瓣分別存在著需終生抗凝和耐久性差的缺陷，同種瓣膜又存在著來源嚴(yán)重不足的限制，因此，都難以滿足臨床的需要。心臟瓣膜組織工程可以克服以上缺陷，構(gòu)建出無免疫源性、可以自我生長修復(fù)的自體活瓣膜替代物，它的研制具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。其中種子細(xì)胞來源和支架材料的制備一直是制約組織工程瓣膜實際應(yīng)用的瓶頸問題，這兩個問題的良好解決對組織工程瓣膜的研

2、制具有決定性意義。外周血內(nèi)皮前體細(xì)胞在體外可分化為成熟內(nèi)皮，它的獲取過程不會對機(jī)體產(chǎn)生創(chuàng)傷；十二烷基肌氨酸鈉是一種氨基酸類表面活性劑，具有低毒、低刺激性的特點(diǎn)。本實驗嘗試以外周血內(nèi)皮前體細(xì)胞作為新的種子細(xì)胞，以十二烷基肌氨酸鈉作為新型脫細(xì)胞試劑制備脫細(xì)胞瓣膜支架，探索內(nèi)皮前體細(xì)胞種植在脫細(xì)胞瓣膜支架上，體外構(gòu)建組織工程瓣膜的可行性并檢測其抗血栓功能。 方法：以密度梯度離心法分離臍血內(nèi)皮前體細(xì)胞，用EGM一2-MV培養(yǎng)液將其往成熟

3、內(nèi)皮方向誘導(dǎo)；從細(xì)胞形態(tài)和內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物的免疫熒光染色兩方面對分化的細(xì)胞加以鑒定。用含有O．25％十二烷基肌氨酸鈉消化液以及核酸酶對豬的帶瓣膜管道進(jìn)行脫細(xì)胞處理以制備脫細(xì)胞支架材料，并對其進(jìn)行DNA、可溶性蛋白含量測定，眥、Movat染色和電鏡觀察，細(xì)胞體外種植實驗，生物力學(xué)測試，大鼠皮下包埋實驗等多方面檢測。將前體分化的細(xì)胞以l×106／cm2的密度種植在脫細(xì)胞瓣膜支架上，體外靜態(tài)培養(yǎng)7～10天，構(gòu)建組織工程瓣膜，以MTT檢測觀

4、察其生長情況，以免疫熒光染色和掃描電鏡觀察內(nèi)膜層形成情況，以血小板黏附實驗和RT-PCR檢測eNOS和tPA基因表達(dá)綜合評價新生內(nèi)膜的抗血栓功能。 結(jié)果：臍血分離的內(nèi)皮前體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后展現(xiàn)出典型的鋪路石樣形態(tài)，吞噬LDL、結(jié)合UEA-1、CD31和vWF染色為陽性，并具有極強(qiáng)的增殖能力。脫細(xì)胞帶瓣膜管道中的細(xì)胞成分幾乎完全去除，瓣葉和管壁中DNA含量為正常的1．35％和2．8l％，可溶性蛋白含量為正常的8．46％和12．65％；

5、肛和Movat染色顯示組織結(jié)構(gòu)完整、細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全消失，膠原纖維、彈性纖維、蛋白聚糖等主要基質(zhì)成分充分保留；細(xì)胞種植顯示支架細(xì)胞相容性良好；瓣膜生物力學(xué)性能與正常無明顯差異；皮下包埋實驗顯示其免疫原性低并具有生物可降解性。MTT檢測表明種植在支架上的內(nèi)皮前體細(xì)胞不但存活，而且代謝活躍，具有良好的增殖能力；掃描電鏡顯示組織工程瓣膜表面完全被細(xì)胞覆蓋，細(xì)胞排列緊密呈鋪路石樣形態(tài)；組織工程瓣膜表面有新生內(nèi)膜層形成，該內(nèi)膜CD3l、vWF染色為陽

6、性，有eNOS和tPA基因的表達(dá)，并能有效地防止血小板在瓣膜表面聚集和粘附；而未種細(xì)胞的瓣膜支架表面為裸露的膠原纖維，其上有大量聚集呈團(tuán)塊的血小板黏附。 結(jié)論：十二烷基肌氨酸鈉是一種理想的脫細(xì)胞試劑，以此可以建立一套低毒、高效、對組織結(jié)構(gòu)無損傷的脫細(xì)胞方法，并制備出生物學(xué)性能優(yōu)異的脫細(xì)胞支架材料。外周血內(nèi)皮前體細(xì)胞是一種新型的種子細(xì)胞來源，它的采集不會造成機(jī)體損傷，在體外可以被迅速的誘導(dǎo)分化為成熟內(nèi)皮，可用于構(gòu)建具有抗血栓功能的