簡介：代謝控制工程提高大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的研究WILLIAMRFARMERANDJAMESCLIAO化學(xué)工程系，加利福尼亞大學(xué)，洛杉磯，CA90034作者LIAOJUCLAEDU收稿日期19990808，接受日期20000222摘要代謝工程在復(fù)雜多樣的宿主內(nèi)產(chǎn)生外源代謝物方面取得了可喜的成果。但是代謝工程途徑主要集中在擴大所需要的酶和解除細胞控制，因此沒有被控制的代謝途徑代謝失衡和不理想的產(chǎn)物出現(xiàn)。我們已經(jīng)闡述了代謝工程的另一種進程，通過設(shè)計調(diào)控回路使調(diào)控子根據(jù)細胞內(nèi)代謝的狀態(tài)來調(diào)節(jié)基因表達。尤其在大腸桿菌中恢復(fù)和改變調(diào)整回路體系中的一個NTR調(diào)控子來控制番茄紅素的生物合成途徑。被過量的糖分解刺激的人造的調(diào)控子，ACP控制番茄紅素中的兩個關(guān)鍵酶的表達，這正響應(yīng)了流體動力學(xué)。這樣當(dāng)減少因代謝失衡引起的消極影響時，細胞內(nèi)操控系統(tǒng)就會明顯提高番茄紅素的產(chǎn)量。雖然我們論證這種可以提高代謝產(chǎn)量的方法，但是它也可被延伸到其他領(lǐng)域，而在這些領(lǐng)域中基因表達必須受細胞生理學(xué)嚴(yán)格的約束，如基因治療。關(guān)鍵詞類胡蘿卜素，類異戊二烯，代謝工程，代謝控制，氮調(diào)控子代謝工程在上個世紀(jì)就被認(rèn)為得益于對生物合成能力的充分理解，把向分析復(fù)雜生物資料和功能基因的學(xué)科進軍作為進步的結(jié)果。這種知識的直接優(yōu)勢是允許合理的新穎的路徑設(shè)計和排除先天反應(yīng)，而為了達到所需結(jié)果這種先天反應(yīng)是不必要的或有害的。但是，隨著代謝途徑越來越有效，代謝工程將面臨著一個新的挑戰(zhàn)即在這些路徑中控制基因表達的調(diào)整層次流程的再設(shè)計。除了要構(gòu)造代謝途徑的遺傳組成成分外，我們還要計劃使他變得像基因表達路徑動力學(xué)那樣重要。很多學(xué)者認(rèn)為重組蛋白質(zhì)或細胞路徑的高水平感應(yīng)現(xiàn)象將導(dǎo)致生長延遲和代謝活力的降低。這些表面特征有以下事實產(chǎn)生不斷的產(chǎn)品需求高于改變細胞生長需求。我們希望這種普便情形能通過設(shè)計一個動力控制器有所減輕，當(dāng)然這個動力控制器能夠感受到細胞的代謝狀態(tài)和控制重組細胞路徑的表達。被命名為代謝控制工程的這種方法包括重新設(shè)計原來的路徑和將它們應(yīng)用于重組細胞路徑。這樣努力的目標(biāo)是控制重組細胞路徑的流量以適應(yīng)細胞新陳代謝的狀態(tài)。動力控制重組細胞路徑可以潛在地導(dǎo)致產(chǎn)量提高、將生長阻礙減小到最小、減少有毒副產(chǎn)品形成。適應(yīng)生理狀態(tài)的基因表達規(guī)則對于基因治療的成功也是十分必要的。這里我們舉一個這種方法應(yīng)用的例子在大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。我們選擇番茄紅素作為典型例子是因為番茄紅素對人類的健康有益。番茄紅素作為一種有效的抗氧化劑，它已經(jīng)被提議治療一些癌癥和其他退行性疾病等，因此，具有活性的番茄紅素的合成物和其它相關(guān)的類胡蘿卜素已經(jīng)越來越受人們的關(guān)注，并且有大量的報道在描述其產(chǎn)品。結(jié)果和討論重組細胞路徑構(gòu)建動力學(xué)控制器。動力控制器的目的是用來控制路徑的流量以利于C和能量的利用。如圖1所示設(shè)計這樣的一個細胞內(nèi)操作系統(tǒng)需要識別器1發(fā)信號分子反射相關(guān)代謝狀態(tài)（2）傳感器監(jiān)視信號（3）控制器處理感覺的輸入（4）控制閥（例如促進器）調(diào)節(jié)基因表達（5）被控制路徑的速度限制裝置。鑒別正確的信號分子和速度限制需要對代謝系統(tǒng)有一個徹底地了解。剩下的成分則由兩種成分組成的調(diào)整體系衍生而來，其中這個體系包括大量的遺傳調(diào)整分子。圖1動力控制學(xué)描繪控制工程的結(jié)構(gòu)圖被控制的過程是從葡萄糖到產(chǎn)物（番茄紅素）和一些廢品（例如醋酸鹽）的代謝途徑。標(biāo)準(zhǔn)變量（或信號）是ACP，ACP提供信號讓剩余的流量變成廢品。感受分子是NRI蛋白,它可以結(jié)合在DNA上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄?？刂崎y是啟動子GLNAP2，它可以在代謝控制系統(tǒng)中控制受限的進程（LDIANDPPS）。圖中虛線盒中指出代謝系統(tǒng)被控制。我們最初的任務(wù)是鑒別一種可以放映細胞內(nèi)代謝狀態(tài)的信號分子和一種能夠監(jiān)控它的傳感器。ACP可做為該代謝狀態(tài)的信號分子，因為他已經(jīng)被用來作為葡萄糖上的指示劑。另外，它也已經(jīng)作為識別兩種混合成分調(diào)節(jié)子的標(biāo)準(zhǔn)，如CHE13,PHO14,ANDNTR15。提高ACP水平可以作為一種好的指示劑。因此，如圖1所示我們的方法是使用ACP作為信號分子來控制酶在想得到的路徑中的表達，同時也充分地利用過多的C流量和改變流量的方向以遠離有毒產(chǎn)物醋酸鹽。為了理解ACP和控制基因表達，我們利用大腸桿菌的NTR調(diào)節(jié)子（圖2）。NTR調(diào)節(jié)子可以讓細胞適應(yīng)氮不足的狀態(tài)但是在大多數(shù)生物反應(yīng)器下它的作用可以忽落，因為此時處于氮充足的環(huán)境下。NTR調(diào)節(jié)子自身的傳感器叫NRII,它是基因GLNL的產(chǎn)物，可以磷酸化的形式將磷酸轉(zhuǎn)移給NRI蛋白，NRI–P進而與AP2結(jié)合位點結(jié)合，啟動AP2的轉(zhuǎn)譯。在NRII缺失時，NRI才能響應(yīng)ACP水平。設(shè)計NRII缺失的回路控制，使NRI對ACP水平及目標(biāo)基因表達做出響應(yīng)（圖2A）。為了重建這種控制單位，我們限定在包含NRI粘合位點的區(qū)域和核GLNAP2啟動子區(qū)域，并且插入DNA片段到克隆載體。NRI粘合位點重疊另一個被CAMPCRP調(diào)控的啟動子GLNAP1。因此DNA片段也包含GLNAP1，但是沒有CAMPCRP粘合位點圖2A。沒有CAMPCRP活性，GLNAP2的活性相當(dāng)?shù)?，并且包含啟動子的信息?gòu)造一個野生型菌株（JCL1595）來支持這個判斷（圖2B）。單一基因表達的動力控制圖2動力學(xué)控制器的描述（A）GLNAP2啟動子在缺乏NRII時，ACP可誘導(dǎo)GLNAP2。NRI,NRI粘合位點GLNAP2核,GLNAP2核序列RBS,GLNA核糖體粘合位點ATG轉(zhuǎn)化開始。標(biāo)注“35”和“10”區(qū)指出兩條RNA聚合酶的位置，其中RNA聚合酶和上游的GLNAP2啟動子相接觸。來自單一復(fù)制GLNAP2LACZ的B,C?GAL活性構(gòu)造（B）細胞密度（在550NM的光學(xué)密度下）和（C）在JCL1595（GLNL）以及JCL1596GLNL中的醋酸鹽分泌物。來自野生型D?GALACTIVITY活性在葡萄糖有氧生長期間單一復(fù)制PLACLACZ和菌株VJS632的生長動力學(xué)。用符號（●）代表細胞生長，（■）代表?GAL的活性，（▽）代表細胞外的醋酸鹽。為了測試作為產(chǎn)物表達動力控制器的GLNAP2的電位，我們引入GLNAP2LACZ信使核糖核酸的融合技術(shù)即通過??噬菌體進入到GLNL宿主菌株JCL1596,同時測量?GAL活性的時間進程。這種菌株包含GLNL2001等位基因。如圖2C所示當(dāng)GLNL宿主分泌醋酸鹽集中時GLNAP2?GAL活性增加，然而沒有啟動子活性的感應(yīng)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)然也沒有適應(yīng)于同基因的野生型（JCL1595）如（圖2B）示。因而在NRII缺失時，GLNAP2能夠?qū)^量的碳流量做出響應(yīng)，而過量的碳流量可以被醋酸鹽的排泄物反映出來。當(dāng)細胞進入最后階段時，生物合成需求減少，細胞開始層現(xiàn)出過量的碳流量。在這時，GLNAP2?GAL活性開始上升。相反在野生型菌株（JCL1595）中GLNAP2?GAL活性相對降低，暗示出GLNAP2LACZ表達被在GLNL菌株JCL1596中的ACP調(diào)控，而不是被GLNAP1中的CAMP激活。如（圖2D）所示，菌株VJS632LAC中染色體PLAC的活性在IPTG感應(yīng)現(xiàn)象后迅速地增加，同時再細胞中完成了恒量水平的表達，這種表達不依賴于生長期。因此，這種靜態(tài)的感應(yīng)現(xiàn)象不適應(yīng)細胞生長改變的需求，高水平的基因表達導(dǎo)致代謝失衡和生長延遲。多種復(fù)制基因表達的動力控制為了測定由GLNAP2提供的動力控制是否能減輕因高水平的蛋白質(zhì)表達導(dǎo)致的代謝失衡和生長延遲，而代謝失衡和生長延遲通常在代謝工程中它是不可避免的。我們常使用兩種不同的代謝的酶，即PPS和DAHP合成酶，他們都處于GLNAP2啟動子的控制下。以前曾報道過，蛋白質(zhì)無理由的過分表達導(dǎo)致生長延遲。盡管如此，當(dāng)處于GLNAP2啟動子的動力控制下表達蛋白質(zhì)時，細胞生長沒有停止，如（圖3A）所示。生長壓抑的缺乏起初歸因于GLNAP2啟動子側(cè)面感應(yīng)現(xiàn)象的動力學(xué)。如（圖3C）所示PPS表達直到穩(wěn)定期才開始增長。因此，GLNAP2啟動子避免過多的由蛋白質(zhì)過度表達所引起的代謝負擔(dān)。圖3蛋白質(zhì)的過度表達動態(tài)的GLNAP2啟動子完成高水平的表達和減少生長延遲（A）來自于質(zhì)粒PS706○的PPS和P2AROG3GLNAP2AROG●的過度表達。宿主菌株是BW18302，它被單獨轉(zhuǎn)化為PAROG、P2AROG3或者沒有質(zhì)粒（▽）。接種后的15小時，來自于每一個菌株的蛋白質(zhì)被分析，通過使用10的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道標(biāo)記蛋白質(zhì)的分子量顯示在凝膠上。貼標(biāo)簽的凝膠跑道’NONE’包含不帶質(zhì)粒BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’PTAC’包含BW18302/PAROG細胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’GLNAP2’包含BW18302/P2AROG3細胞汁（B）來自BW18302的PTACPPS（○）和GLNAP2PPS●的過度復(fù)制與沒有質(zhì)粒控制（▽）的比較。接種后的15小時，蛋白質(zhì)被分析，通過使用8的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道包含分子質(zhì)量標(biāo)志，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’NONE’包含不帶質(zhì)粒的BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’PTAC’BW18302/PPS706細胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’GLNAP2’包含BW18302/PPS7番茄紅素路徑的動力學(xué)控制當(dāng)避免生長延遲時，由GLNAP2提供的動力控制可以被用來提高特殊基因的表達水平。因此我們利用調(diào)節(jié)分子來重組細胞路徑以達到提高番茄紅素的生物合成，這樣可以擴大在大腸桿菌中來自類異戊二烯路徑的范圍。大腸桿菌中的類異戊二烯利用丙酮酸鹽和G3P作為先驅(qū)，如圖4A所示。我們在大腸桿菌中改造一個重組體番茄紅素路徑，通過表達基因等。這些基因DXS、GPS、CRTBI插入低拷貝質(zhì)粒PCL1920構(gòu)建質(zhì)粒PCW9，同時過量表達。在這個路徑里，GPS和IDI已經(jīng)被識別用來控制流量到最終產(chǎn)品。另外，我們已經(jīng)表明磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PPS基因產(chǎn)物）控制丙酮酸鹽和G3P的平衡，從而也控制了到類異戊二烯路徑的流量。為了有力的控制碳流量，我們使用GLNAP2啟動子來控制GPS和IDI的表達。這些質(zhì)粒被單獨引入到包含PCW9的GLN菌株BW18302。如（圖5A）所示，P2IDI菌株GLNAP2IDI在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中26小時后生產(chǎn)出100MG/L的番茄紅素。另一方面包含PTACIDIPTACIDI的菌株，在相同的條圖4番茄紅素產(chǎn)品的代謝控制工程（A）用基因DXS、GPS、IDI和CRTBI、G3P、丙酮酸鹽、3磷酸鹽、IPP、PYR、DMAPP、二甲基二磷酸、FPP、GPP、GGPP等重建番茄紅素路徑（B）利用IDI和PPS的動力學(xué)控制來改變代謝流量到番茄紅素路徑策略。兩種類型的帶點線代表應(yīng)用到IDI和PPS（）和碳流量到番茄紅素路徑的變更（）的控制電路。GLC，葡萄糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸鹽；ACP，乙酰磷酸鹽；ACE，醋酸鹽；LYC、番茄紅素。件下僅生產(chǎn)出少量的番茄紅素。加之，P2IDI菌株生產(chǎn)的醋酸鹽比PTACIDI生產(chǎn)的少3倍，這表明到醋酸鹽的碳流量被改道到番茄紅素，如（圖5A）所示。PTACIDI菌株本身生產(chǎn)類似的發(fā)酵樣品作為BW18302宿主控制，它暗示在這個菌株中番茄紅素的表達沒有改變代謝流量（圖5D）。這些結(jié)果被概括于表1。來自P2IDI菌株的丙酮酸鹽排泄物仍然很高，即使在大多數(shù)時間進程中它少于PTACIDI生產(chǎn)的量（圖5C）。自從丙酮酸鹽成為類異戊二烯路徑的先驅(qū)之一來自細胞內(nèi)代謝物的排泄指出碳仍然不能有效地轉(zhuǎn)移到番茄紅素。盡管如此，PPS過量表達在糖分解的條件下也可以引起生長抑制（圖2B）。這樣為了避免代謝失衡PPS過量表達，最終的番茄紅素生產(chǎn)的菌株包含一個可以控制IDI和PPSGLNAP2IDIGLNAP2PPS的人造調(diào)節(jié)子，番茄紅素路徑的剩余物DXS,GPS,CRTBI在PTAC的控制下。番茄紅素的濃度增加50引起生產(chǎn)量增加三倍，從005MG/MLH到016MG/MLH如圖5A所示。這和他的包含PTACIDI和PPS184PTACIDIPTACPPS的菌株相對照，這種菌株沒有出現(xiàn)生長延遲現(xiàn)象如圖5D示。明顯的，在GLNAP2調(diào)節(jié)子中的PPS再表達通過增加丙酮酸鹽的利用為番茄紅素增產(chǎn)創(chuàng)造了條件（如圖5C和表1所示）圖5通過ACP和GLNAP2的動力學(xué)控制從大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。（A）含有15的葡萄糖YE培養(yǎng)基中番茄紅素的產(chǎn)量。（B）乙酸的分泌物。（C）丙酮酸鹽的分泌物。（D）生長活力這些結(jié)果表明由GLNAP2人造調(diào)節(jié)子提供的的動力學(xué)控制允許速率控制酶的表達，這些酶用來幫助番茄紅素的生物合成。此外，這些結(jié)果為代謝工程提出一個有效的策略。而不是向過去那樣試圖刪除調(diào)整的回路，或者試圖通過過量表達關(guān)鍵酶來壓制他們。我們認(rèn)為，再某些情況下，代謝失衡可以通過合理的方式調(diào)整控制來處理。這種方法不僅可以最優(yōu)化代謝路徑，也可以修改對生物工藝學(xué)重要的細胞的活力。例如，細胞循環(huán)規(guī)則、蛋白質(zhì)置換和高水平蛋白質(zhì)產(chǎn)品。另外，他可能成為基因治療的重要手段，但是合理的控制電路設(shè)計擴大路徑的雙重應(yīng)用將變成為一有效的設(shè)計工業(yè)應(yīng)用微生物的方法。實驗方案材料所有的化學(xué)藥品來自SIGMASTLOUIS,MO修飾和限制酶來自生命工藝。所有的PCR相關(guān)材料來自PROMEGAMADISON,WI,寡核苷酸來自GENOSYSTHEWOODLANDS,TX。細菌菌株和質(zhì)粒大腸桿菌菌株BW13711LACX74ANDBW18302LACX74GLNL2001由密歇根大學(xué)ALEXNINFA友好提供。菌株VJS632K12PROTOTROPH由加利福尼亞大學(xué)DAVIS提供。菌株JCL1595和JCL1596通過把溶解的GLNAP2LACZ合在一起而構(gòu)建出來，用來構(gòu)建菌株JCL1595和JCL1596的質(zhì)粒PSR551和ΛRS45抗菌素由洛杉磯加利福尼亞大學(xué)BOBSIMON慷慨贈送。質(zhì)粒PRW5TKT33和PJF118EH23分別由PALOALT和密芝根州立大學(xué)MICHAELBAGDASARIAN慷慨贈送。質(zhì)粒PAROG通過克隆包含來自PRW5TKT的AROGFBR的PCR片段插入到PJF118EH的位點ECORIBAMHI而構(gòu)建，質(zhì)粒PTACIDI通過克隆包含來自大腸桿菌染色體的IDI的PCR片段到PJF118EH的位點ECORIPSTI而構(gòu)建質(zhì)粒PPS706已經(jīng)被描述。包含啟動子和兩個NRI粘合位點的GLNAP2啟動子區(qū)域是來自利用前導(dǎo)引物5?CAGCTGCAAAGGTCATTGCACCAAC和逆轉(zhuǎn)引物5?GGTACCAGTACGTGTTCAGCGGACATAC大腸桿菌染色體的PCR擴增，這兩條引物放大了產(chǎn)生DNA序列在93和343之間位置的區(qū)域。包含GLNAP2啟動子的PCR片段被克隆到質(zhì)粒PAROG、PPS706和PTACIDI的ECORVECORI位點以分別產(chǎn)生質(zhì)粒P2AROG3、PPSG706和P2IDI。質(zhì)粒PPS184和PPSG184通過切斷分別來自PPS706、PPSG706的PTACPPS、GLNAP2PPS片段、使用ECORVANDBAMHI以及插入到PACYC184相應(yīng)的位點而構(gòu)建。GLNAP2PCR片段被克隆到PRS551的位點ECORI，這樣就生產(chǎn)出含有GLNAP2的P2GFPUV。GLNAP2LACZ區(qū)域通過相同的重組被轉(zhuǎn)移到?RS45?以產(chǎn)生?P2GFPUV抗菌體。生長條件??所有大腸桿菌菌株生長在固定培養(yǎng)基的搖動長頸瓶中，培養(yǎng)液置于含有05葡萄糖的M9固定鹽或者含有15葡萄糖的YE固定鹽組成的中等培養(yǎng)基中生長。YE固定鹽由14G/LK2HPO4,、16G/LKH2PO4、5G/LNH42SO4、1GMGSO4和1MG/L硫胺組成。細胞混合物在550NM的波長下被檢測。SDSPAGE和酶的分析LAEMMLI描述出SDSPAGE的草案，Β牛乳糖活力的測定由MILLER來完成。METABOLICCONTROLENGINEERINGTOIMPROVETHEPRODUCTIONOFECOLILYCOPENEWILLIAMRFARMERANDJAMESCLIAODEPARTMENTOFCHEMICALENGINEERING,UNIVERSITYOFCALIFORNIA,LOSANGELES,CA90034AUTHORLIAOJUCLAEDURECEIVED19990808,ACCEPTED20000222ABSTRACTSUMMARYOFMETABOLICENGINEERINGINCOMPLEXANDDIVERSEHOSTOFEXOGENOUSMETABOLITESHASMADEGRATIFYINGACHIEVEMENTSBUTTHEMETABOLICENGINEERINGAPPROACHMAINLYTOEXPANDTHENECESSARYENZYMESANDTHEDISCHARGEDCELFIGURE3PROTEINOVEREXPRESSIONTHEDYNAMICGLNAP2PROMOTERCOMPLETEDAHIGHLEVELOFEXPRESSIONANDREDUCEDGROWTHDELAYAFROMTHEOVEREXPRESSIONOFTHEPLASMIDPS706○PPSANDP2AROG3GLNAP2AROG●THEHOSTSTRAINBW18302,ITISINDIVIDUALLYTRANSFORMEDINTOPAROG,P2AROG3,ORNOPLASMID▽15HOURSAFTERINOCULATION,DERIVEDFROMASTRAINPROTEINISANALYZEDBYSDSPAGEUSING10GELSRIGHTPANELMARKERPROTEINHASAMOLECULARWEIGHTMGELRUNWAYISSHOWNONTHEGELLABELINGOFGEEXPERIMENTALPROGRAMMATERIALSALLCHEMICALSFROMSIGMASTLOUIS,MOMODIFICATIONANDRESTRICTIONENZYMEFROMTHELIFEPROCESSALLPCRRELATEDMATERIALSFROMPROMEGAMADISON,WI,OLIGONUCLEOTIDESFROMGENOSYSTHEWOODLANDS,TXBACTERIALSTRAINSANDPLASMIDSECOLISTRAINBW13711LACX74ANDBW18302LACX74GLNL2001BYALEXNINFAFRIENDLY,THEUNIVERSITYOFMICHIGANSTRAINSVJS632K12PROTOTROPHPROVIDEDBYTHEUNIVERSITYOFCALIFORNIA,DAVISSTRAINSJCL1595ANDJCL1596DISSOLV
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