生物工程外文翻譯--代謝控制工程提高大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的研究

1、<p>　　代謝控制工程提高大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量的研究</p><p>　　William R. Farmer and James C. Liao*</p><p>　　化學(xué)工程系，加利福尼亞大學(xué)，洛杉磯，CA 90034.*作者(liaoj@ucla.edu).</p><p>　　收稿日期：1999.08.08，接受日期：2000.02.22</

2、p><p>　　摘要 代謝工程在復(fù)雜多樣的宿主內(nèi)產(chǎn)生外源代謝物方面取得了可喜的成果。但是代謝工程途徑主要集中在擴(kuò)大所需要的酶和解除細(xì)胞控制，因此沒有被控制的代謝途徑代謝失衡和不理想的產(chǎn)物出現(xiàn)。我們已經(jīng)闡述了代謝工程的另一種進(jìn)程，通過設(shè)計(jì)調(diào)控回路使調(diào)控子根據(jù)細(xì)胞內(nèi)代謝的狀態(tài)來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。尤其在大腸桿菌中恢復(fù)和改變調(diào)整回路體系中的一個Ntr調(diào)控子來控制番茄紅素的生物合成途徑。被過量的糖分解刺激的人造的調(diào)控子，ACP控

3、制番茄紅素中的兩個關(guān)鍵酶的表達(dá)，這正響應(yīng)了流體動力學(xué)。這樣當(dāng)減少因代謝失衡引起的消極影響時，細(xì)胞內(nèi)操控系統(tǒng)就會明顯提高番茄紅素的產(chǎn)量。雖然我們論證這種可以提高代謝產(chǎn)量的方法，但是它也可被延伸到其他領(lǐng)域，而在這些領(lǐng)域中基因表達(dá)必須受細(xì)胞生理學(xué)嚴(yán)格的約束，如基因治療。</p><p>　　關(guān)鍵詞：類胡蘿卜素，類異戊二烯，代謝工程，代謝控制，氮調(diào)控子</p><p>　　代謝工程在上個世紀(jì)就被認(rèn)

4、為得益于對生物合成能力的充分理解，把向分析復(fù)雜生物資料和功能基因的學(xué)科進(jìn)軍作為進(jìn)步的結(jié)果。這種知識的直接優(yōu)勢是允許合理的新穎的路徑設(shè)計(jì)和排除先天反應(yīng)，而為了達(dá)到所需結(jié)果這種先天反應(yīng)是不必要的或有害的。但是，隨著代謝途徑越來越有效，代謝工程將面臨著一個新的挑戰(zhàn)：即在這些路徑中控制基因表達(dá)的調(diào)整層次流程的再設(shè)計(jì)。除了要構(gòu)造代謝途徑的遺傳組成成分外，我們還要計(jì)劃使他變得像基因表達(dá)路徑動力學(xué)那樣重要。</p><p>　

5、　很多學(xué)者認(rèn)為重組蛋白質(zhì)或細(xì)胞路徑的高水平感應(yīng)現(xiàn)象將導(dǎo)致生長延遲和代謝活力的降低。這些表面特征有以下事實(shí)產(chǎn)生：不斷的產(chǎn)品需求高于改變細(xì)胞生長需求。我們希望這種普便情形能通過設(shè)計(jì)一個動力控制器有所減輕，當(dāng)然這個動力控制器能夠感受到細(xì)胞的代謝狀態(tài)和控制重組細(xì)胞路徑的表達(dá)。</p><p>　　被命名為代謝控制工程的這種方法包括重新設(shè)計(jì)原來的路徑和將它們應(yīng)用于重組細(xì)胞路徑。這樣努力的目標(biāo)是控制重組細(xì)胞路徑的流量以適應(yīng)細(xì)

6、胞新陳代謝的狀態(tài)。動力控制重組細(xì)胞路徑可以潛在地導(dǎo)致產(chǎn)量提高、將生長阻礙減小到最小、減少有毒副產(chǎn)品形成。適應(yīng)生理狀態(tài)的基因表達(dá)規(guī)則對于基因治療的成功也是十分必要的。這里我們舉一個這種方法應(yīng)用的例子——在大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。</p><p>　　我們選擇番茄紅素作為典型例子是因?yàn)榉鸭t素對人類的健康有益。番茄紅素作為一種有效的抗氧化劑，它已經(jīng)被提議治療一些癌癥和其他退行性疾病等，因此，具有活性的番茄紅素的

7、合成物和其它相關(guān)的類胡蘿卜素已經(jīng)越來越受人們的關(guān)注，并且有大量的報道在描述其產(chǎn)品。</p><p><b>　　結(jié)果和討論</b></p><p>　　重組細(xì)胞路徑構(gòu)建動力學(xué)控制器。</p><p>　　動力控制器的目的是用來控制路徑的流量以利于C和能量的利用。如圖1所示：設(shè)計(jì)這樣的一個細(xì)胞內(nèi)操作系統(tǒng)需要識別器: ( 1 )發(fā)信號分子反射相關(guān)代

8、謝狀態(tài) （2）傳感器監(jiān)視信號 （3）控制器處理感覺的輸入 （4）控制閥（例如: 促進(jìn)器）調(diào)節(jié)基因表達(dá)（5）被控制路徑的速度限制裝置。 鑒別正確的信號分子和速度限制需要對代謝系統(tǒng)有一個徹底地了解。剩下的成分則由兩種成分組成的調(diào)整體系衍生而來，其中這個體系包括大量的遺傳調(diào)整分子。</p><p>　　圖1. 動力控制學(xué)描繪控制工程的結(jié)構(gòu)圖</p><p>　　被控制的過程是從葡萄糖到產(chǎn)物（番茄

9、紅素）和一些廢品（例如：醋酸鹽）的代謝途徑。標(biāo)準(zhǔn)變量（或信號）是ACP，ACP提供信號讓剩余的流量變成廢品。感受分子是NRI蛋白,它可以結(jié)合在DNA上調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄?？刂崎y是啟動子glnAp2，它可以在代謝控制系統(tǒng)中控制受限的進(jìn)程（Ldi and Pps）。圖中虛線盒中指出代謝系統(tǒng)被控制。</p><p>　　我們最初的任務(wù)是鑒別一種可以放映細(xì)胞內(nèi)代謝狀態(tài)的信號分子和一種能夠監(jiān)控它的傳感器。ACP可做為該代謝狀態(tài)的信號

10、分子，因?yàn)樗呀?jīng)被用來作為葡萄糖上的指示劑。另外，它也已經(jīng)作為識別兩種混合成分調(diào)節(jié)子的標(biāo)準(zhǔn)，如Che13, Pho14, and Ntr15。提高ACP水平可以作為一種好的指示劑。因此，如圖1所示我們的方法是使用ACP作為信號分子來控制酶在想得到的路徑中的表達(dá)，同時也充分地利用過多的C流量和改變流量的方向以遠(yuǎn)離有毒產(chǎn)物醋酸鹽。</p><p>　　為了理解ACP和控制基因表達(dá)，我們利用大腸桿菌的Ntr調(diào)節(jié)子（圖2

11、）。Ntr調(diào)節(jié)子可以讓細(xì)胞適應(yīng)氮不足的狀態(tài)但是在大多數(shù)生物反應(yīng)器下它的作用可以忽落，因?yàn)榇藭r處于氮充足的環(huán)境下。Ntr調(diào)節(jié)子自身的傳感器叫NRII,它是基因glnL的產(chǎn)物，可以磷酸化的形式將磷酸轉(zhuǎn)移給NRI蛋白，NRI–P進(jìn)而與AP2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，啟動AP2的轉(zhuǎn)譯。在NRII缺失時，NRI才能響應(yīng)ACP水平。設(shè)計(jì)NRII缺失的回路控制，使NRI對ACP水平及目標(biāo)基因表達(dá)做出響應(yīng)（圖2A）。</p><p>　　為

12、了重建這種控制單位，我們限定在包含NRI粘合位點(diǎn)的區(qū)域和核glnAp2啟動子區(qū)域，并且插入DNA片段到克隆載體。NRI粘合位點(diǎn)重疊另一個被cAMP-CRP調(diào)控的啟動子glnAP1。因此DNA片段也包含glnAP1，但是沒有cAMP-CRP粘合位點(diǎn)(圖2A)。沒有cAMP-CRP活性，glnAp2的活性相當(dāng)?shù)?，并且包含啟動子的信息?gòu)造一個野生型菌株（JCL1595）來支持這個判斷（圖2B）。</p><p>　　單

13、一基因表達(dá)的動力控制</p><p>　　圖2. 動力學(xué)控制器的描述</p><p>　?。ˋ）glnAp2啟動子 在缺乏NRII時，ACP可誘導(dǎo)glnAp2。 NRI, NRI-粘合位點(diǎn); glnAp2核, glnAp2 核序列; RBS, glnA 核糖體粘合位點(diǎn); ATG轉(zhuǎn)化開始。標(biāo)注“-35” 和“-10”區(qū)指出兩條RNA聚合酶的位置，其中RNA聚合酶和上游的glnAp2啟動子

14、相接觸。來自單一復(fù)制glnAp2-lacZ的(B, C) ?-Gal活性構(gòu)造（B）細(xì)胞密度（在550nm的光學(xué)密度下）和（C）在JCL1595（glnL+）以及JCL 1596glnL)中的醋酸鹽分泌物。來自野生型 (D) ?-Gal activity活性在葡萄糖有氧生長期間單一復(fù)制Plac-lacZ和菌株VJS632的生長動力學(xué)。用符號（●）代表細(xì)胞生長，（■）代表?-gal的活性，（▽）代表細(xì)胞外的醋酸鹽。</p>&

15、lt;p>　　為了測試作為產(chǎn)物表達(dá)動力控制器的glnAp2的電位，我們引入glnAp2-lacZ信使核糖核酸的融合技術(shù)即通過??噬菌體進(jìn)入到glnL宿主菌株(JCL1596),同時測量?-gal活性的時間進(jìn)程。這種菌株包含glnL2001等位基因。如圖2 C所示：當(dāng)glnL宿主分泌醋酸鹽集中時glnAp2-?-gal活性增加，然而沒有啟動子活性的感應(yīng)現(xiàn)象被發(fā)現(xiàn)，當(dāng)然也沒有適應(yīng)于同基因的野生型（JCL1595）如（圖2B）示。因而在

16、NRII缺失時，glnAp2能夠?qū)^量的碳流量做出響應(yīng)，而過量的碳流量可以被醋酸鹽的排泄物反映出來。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入最后階段時，生物合成需求減少，細(xì)胞開始層現(xiàn)出過量的碳流量。在這時，glnAp2-?-gal活性開始上升。相反在野生型菌株（JCL1595）中g(shù)lnAp2-?-gal活性相對降低，暗示出glnAp2-lacZ表達(dá)被在glnL菌株(JCL1596)中的ACP調(diào)控，而不是被glnAp1中的cAMP激活。</p><

17、p>　　如（圖2 D）所示，菌株VJS632 (lac+)中染色體Plac的活性在IPTG感應(yīng)現(xiàn)象后迅速地增加，同時再細(xì)胞中完成了恒量水平的表達(dá)，這種表達(dá)不依賴于生長期。因此，這種靜態(tài)的感應(yīng)現(xiàn)象不適應(yīng)細(xì)胞生長改變的需求，高水平的基因表達(dá)導(dǎo)致代謝失衡和生長延遲。</p><p>　　多種復(fù)制基因表達(dá)的動力控制</p><p>　　為了測定由glnAp2提供的動力控制是否能減輕因高水平的

18、蛋白質(zhì)表達(dá)導(dǎo)致的代謝失衡和生長延遲，而代謝失衡和生長延遲通常在代謝工程中它是不可避免的。我們常使用兩種不同的代謝的酶，即：Pps和DAHP合成酶，他們都處于glnAp2啟動子的控制下。以前曾報道過，蛋白質(zhì)無理由的過分表達(dá)導(dǎo)致生長延遲。盡管如此，當(dāng)處于glnAp2啟動子的動力控制下表達(dá)蛋白質(zhì)時，細(xì)胞生長沒有停止，如（圖3 A）所示。生長壓抑的缺乏起初歸因于glnAp2啟動子側(cè)面感應(yīng)現(xiàn)象的動力學(xué)。如（圖3 C）所示Pps表達(dá)直到穩(wěn)定期才開始

19、增長。因此，glnAp2啟動子避免過多的由蛋白質(zhì)過度表達(dá)所引起的代謝負(fù)擔(dān)。</p><p>　　圖3. 蛋白質(zhì)的過度表達(dá)</p><p>　　動態(tài)的glnAp2啟動子完成高水平的表達(dá)和減少生長延遲（A）來自于質(zhì)粒ps706(○)的Pps和p2AROG3 (glnAp2-aroG) (●)的過度表達(dá)。宿主菌株是BW18302，它被單獨(dú)轉(zhuǎn)化為pAROG、p2AROG3或者沒有質(zhì)粒（▽）。接種后

20、的15小時，來自于每一個菌株的蛋白質(zhì)被分析，通過使用10%的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道---標(biāo)記蛋白質(zhì)的分子量顯示在凝膠上。貼標(biāo)簽的凝膠跑道’none’包含不帶質(zhì)粒BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’Ptac’包含BW18302/pAROG細(xì)胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’ glnAp2’包含BW18302/p2AROG3細(xì)胞汁（B）來自BW18302的Ptac-pps（○）和glnAp2-pps(●)的過度復(fù)制與沒有質(zhì)?？刂?/p>

21、（▽）的比較。接種后的15小時，蛋白質(zhì)被分析，通過使用8%的凝膠（合適的面板）SDS–PAGE。M凝膠跑道包含分子質(zhì)量標(biāo)志，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’none’包含不帶質(zhì)粒的BW18302，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’Ptac’ BW18302/pPs706細(xì)胞汁，貼標(biāo)簽的凝膠跑道’ glnAp2’包含BW18302/pPs7</p><p>　　番茄紅素路徑的動力學(xué)控制</p><p>　　當(dāng)避免生長延遲

22、時，由glnAp2提供的動力控制可以被用來提高特殊基因的表達(dá)水平。因此我們利用調(diào)節(jié)分子來重組細(xì)胞路徑以達(dá)到提高番茄紅素的生物合成，這樣可以擴(kuò)大在大腸桿菌中來自類異戊二烯路徑的范圍。大腸桿菌中的類異戊二烯利用丙酮酸鹽和G3P作為先驅(qū)，如圖4 A所示。我們在大腸桿菌中改造一個重組體番茄紅素路徑，通過表達(dá)基因等。這些基因dxs 、gps 、crtBI 插入低拷貝質(zhì)粒 pCL1920 構(gòu)建質(zhì)粒pCW9，同時過量表達(dá)。在這個路徑里，gps和idi

23、已經(jīng)被識別用來控制流量到最終產(chǎn)品。另外，我們已經(jīng)表明磷酸烯醇丙酮酸合成酶（PPS基因產(chǎn)物）控制丙酮酸鹽和G3P的平衡，從而也控制了到類異戊二烯路徑的流量。為了有力的控制碳流量，我們使用glnAp2啟動子來控制gps和idi的表達(dá)。這些質(zhì)粒被單獨(dú)引入到包含pCW9的gln菌株(BW18302)。</p><p>　　如（圖5A）所示，p2IDI菌株(glnAp2-idi)在含有葡萄糖的培養(yǎng)基中26小時后生產(chǎn)出100

24、 mg/l的番茄紅素。另一方面包含Ptac-idi (pTacIDI)的菌株，在相同的條</p><p>　　圖4. 番茄紅素產(chǎn)品的代謝控制工程</p><p>　?。ˋ）用基因dxs 、gps 、idi和crtBI、G3P、丙酮酸鹽、3-磷酸鹽、IPP、Pyr、DMAPP、二甲基二磷酸、FPP、GPP、GGPP等重建番茄紅素路徑 （B）利用IDI 和PPS的動力學(xué)控制來改變代謝流量到番茄

25、紅素路徑策略。兩種類型的帶點(diǎn)線代表應(yīng)用到IDI 和PPS（------）和碳流量到番茄紅素路徑的變更（……）的控制電路。Glc，葡萄糖；PEP，磷酸烯醇丙酮酸鹽；ACP，乙酰磷酸鹽；Ace，醋酸鹽；Lyc、番茄紅素。</p><p>　　件下僅生產(chǎn)出少量的番茄紅素。加之，p2IDI菌株生產(chǎn)的醋酸鹽比pTacIDI生產(chǎn)的少3倍，這表明到醋酸鹽的碳流量被改道到番茄紅素，如（圖5A）所示。pTacIDI菌株本身生產(chǎn)類似

26、的發(fā)酵樣品作為BW18302宿主控制，它暗示在這個菌株中番茄紅素的表達(dá)沒有改變代謝流量（圖5 D）。這些結(jié)果被概括于表1。</p><p>　　來自p2IDI菌株的丙酮酸鹽排泄物仍然很高，即使在大多數(shù)時間進(jìn)程中它少于pTacIDI生產(chǎn)的量（圖5 C）。自從丙酮酸鹽成為類異戊二烯路徑的先驅(qū)之一來自細(xì)胞內(nèi)代謝物的排泄指出碳仍然不能有效地轉(zhuǎn)移到番茄紅素。盡管如此，PPS過量表達(dá)在糖分解的條件下也可以引起生長抑制（圖2B

27、）。這樣為了避免代謝失衡PPS過量表達(dá)，最終的番茄紅素生產(chǎn)的菌株包含一個可以控制idi和pps(glnAp2-idi + glnAp2-pps)的人造調(diào)節(jié)子，番茄紅素路徑的剩余物(dxs, gps, crtBI)在Ptac的控制下。番茄紅素的濃度增加50%引起生產(chǎn)量增加三倍，從0.05(mg/ml.h)到0.16(mg/ml.h)如圖5A所示。這和他的包含pTacIDI 和 pPS184 (Ptac-idi + Ptac-pps)的菌株

28、相對照，這種菌株沒有出現(xiàn)生長延遲現(xiàn)象如圖5D示。明顯的，在glnAp2調(diào)節(jié)子中的PPS再表達(dá)通過增加丙酮酸鹽的利用為番茄紅素增產(chǎn)創(chuàng)造了條件（如圖5C和表1所示）</p><p>　　圖5 通過ACP和glnAp2的動力學(xué)控制從大腸桿菌中提高番茄紅素的產(chǎn)量。</p><p>　?。ˋ） 含有1.5%的葡萄糖YE培養(yǎng)基中番茄紅素的產(chǎn)量。（B）乙酸的分泌物。（C）丙酮酸鹽的分泌物。（D）生長活力

29、 </p><p>　　這些結(jié)果表明由glnAp2人造調(diào)節(jié)子提供的的動力學(xué)控制允許速率控制酶的表達(dá)，這些酶用來幫助番茄紅素的生物合成。此外，這些結(jié)果為代謝工程提出一個有效的策略。而不是向過去那樣試圖刪除調(diào)整的回路，或者試圖通過過量表達(dá)關(guān)鍵酶來壓制他們。我們認(rèn)為，再某些情況下，代謝失衡可以通過合理的方式調(diào)整控制來處理。這種方法不僅可以最優(yōu)化代謝路徑，也可以修改對生物工藝學(xué)重要

30、的細(xì)胞的活力。例如，細(xì)胞循環(huán)規(guī)則、蛋白質(zhì)置換和高水平蛋白質(zhì)產(chǎn)品。另外，他可能成為基因治療的重要手段，但是合理的控制電路設(shè)計(jì)擴(kuò)大路徑的雙重應(yīng)用將變成為一有效的設(shè)計(jì)工業(yè)應(yīng)用微生物的方法。</p><p><b>　　實(shí)驗(yàn)方案</b></p><p>　　材料 所有的化學(xué)藥品來自Sigma(St. Louis, MO).修飾和限制酶來自生命工藝。所有的PCR相關(guān)材料來自P

31、romega (Madison, WI),寡核苷酸來自Genosys (The Woodlands, TX)。</p><p>　　細(xì)菌菌株和質(zhì)粒 大腸桿菌菌株BW13711 (lacX74) and BW18302 (lacX74glnL20</p><p>　　01)由密歇根大學(xué)Alex Ninfa友好提供。菌株VJS632 (K-12 prototroph)由加利福尼亞大學(xué)Davi

32、s提供。菌株JCL1595和JCL1596通過把溶解的glnAP2-lacZ合在一起而構(gòu)建出來，用來構(gòu)建菌株JCL1595和JCL1596的質(zhì)粒PSR551和λRS45抗菌素由洛杉磯加利福尼亞大學(xué)Bob Simon慷慨贈送。質(zhì)粒pRW5tkt33和 pJF118EH23分別由Palo Alt和密芝根州立大學(xué)Michael Bagdasarian 慷慨贈送。質(zhì)粒PAROG通過克隆包含來自pRW5tkt的aroGfbr的PCR片段插入到pJ

33、F118EH的位點(diǎn) EcoRI-BamHI而構(gòu)建， 質(zhì)粒pTacIDI通過克隆包含來自大腸桿菌染色體的idi的PCR片段到pJF118EH的位點(diǎn) EcoRI-PstI而構(gòu)建.質(zhì)粒PPS706已經(jīng)被描述。包含啟動子和兩個NRI粘合位點(diǎn)的glnAP2啟動子區(qū)域是來自利用前導(dǎo)引物5?-CAGCTGCAAAGGTCATTGCAC</p><p>　　CAAC 和逆轉(zhuǎn)引物5?-GGTACCAGTACGTGTTCAGCGGA

34、CATAC大腸桿菌染色體的PCR擴(kuò)增，這兩條引物放大了產(chǎn)生DNA序列在93和343之間位置的區(qū)域。包含glnAP2啟動子的PCR片段被克隆到質(zhì)粒pAROG、pPS706和pTacIDI的EcoRV</p><p>　　-EcoRI位點(diǎn)以分別產(chǎn)生質(zhì)粒p2AROG3、pPSG706和p2IDI。質(zhì)粒pPS184和pPSG184通過切斷分別來自pPS706、pPSG706的Ptac-pps、glnAp2-pps片段、使

35、用EcoRV and BamHI以及插入到pACYC184相應(yīng)的位點(diǎn)而構(gòu)建。glnAp2 PCR片段被克隆到pRS5</p><p>　　51的位點(diǎn)EcoRI，這樣就生產(chǎn)出含有g(shù)lnAp2的p2GFPuv。glnAp2-lacZ區(qū)域通過相同的重組被轉(zhuǎn)移到?RS45?以產(chǎn)生?p2GFPuv抗菌體。</p><p>　　生長條件??所有大腸桿菌菌株生長在固定培養(yǎng)基的搖動長頸瓶中，培養(yǎng)液置于含有

36、0.5%葡萄糖的M9固定鹽或者含有1.5%葡萄糖的YE固定鹽組成的中等培養(yǎng)基中生長。YE固定鹽由14 g/l K2HPO4,、16 g/l KH2PO4、 5g /l (NH4)2SO4、1 g MgSO4和1 mg/l 硫胺組成。細(xì)胞混合物在550nm的波長下被檢測。</p><p>　　SDS-PAGE和酶的分析 Laemmli描述出SDS-PAGE的草案，β-牛乳糖活力的測定由Miller來完成。<

37、;/p><p>　　Metabolic control engineering to improve the production of E. coli lycopeneWilliam R. Farmer and James C. Liao *Department of Chemical Engineering, University of California, Los Angeles, CA 90034 *

38、Author (liaoj@ucla.edu).Received: 1999.08.08, Accepted: 2000.02.22 Abstract Summary of metabolic engineering in complex and diverse host of exogenous metabolites has made gratifying achievements. But the metabolic en

39、gineering approach mainly to expand the necessary enzymes and the discharged cel</p><p><b>　　Figure 3 </b></p><p>　　protein overexpressionThe dynamic glnAp2 promoter completed a hig

40、h level of expression and reduced growth delay (A) from the over-expression of the plasmid ps706 (○) PPS and p2AROG3 (glnAp2-aroG) (●). The host strain BW18302, it is individually transformed into pAROG, p2AROG3, or no p

41、lasmid (▽). 15 hours after inoculation, derived from a strain protein is analyzed by SDS-PAGE using 10% gels (right panel). --- Marker protein has a molecular weight M gel runway is shown on the gel. Labeling of ge</p

42、><p>　　Experimental program Materials All chemicals from Sigma (St. Louis, MO). Modification and restriction enzyme from the life process. All PCR-related materials from Promega (Madison, WI), oligonucleotides

43、 from Genosys (The Woodlands, TX).Bacterial strains and plasmids E. coli strain BW13711 (lacX74) and BW18302 (lacX74glnL2001) by Alex Ninfa friendly, the University of Michigan. Strains VJS632 (K-12 prototroph) provide