簡(jiǎn)介：太原理工大學(xué)碩士學(xué)位論文ITRANSLATIONREPTONEXCERPTSOFATEXTBOOKFHIGHEREDUCATIONCELLMOLECULARBIOLOGYCONCEPTSEXPERIMENTS7THEDITIONABSTRACTBOOMINGBIOLOGICALSCIENCETECHNOLOGYIN21STCENTURYBOOSTSTHEDEVELOPMENTOFFOODPRODUCTIONMEDICALCAREMANYENGINEERINGDOMAINSLEADINGTOENMOUSEFFTSINTHECULTIVATIONOFBIOLOGICALTALENTSINBOTHBASICAPPLIEDRESEARCHITHASCREATEDAGREATDEMOFTRANSLATEDBIOLOGICALTEXTBOOKSTHROUGHREADINGTRANSLATEDTEXTBOOKSSTUDENTSGAINACOMPREHENSIVEPICTUREABOUTBIOLOGYACQUIREACCURATEPROFESSIONALKNOWLEDGETHELATESTPROGRESSOFTHISDISCIPLINEAREALSOPRESENTEDINTRODUCEDINTHESETEXTBOOKSTHEREPTISBASEDONTRANSLATIONPRACTICEOFCELLMOLECULARBIOLOGYCONCEPTSEXPERIMENTS7THEDITIONBYGERALDKARPFROMTHEIGINALBOOKSEVENTEENSECTIONSOFHUMANPERSPECTIVEARECOLLECTEDTHELENGTHOFWHICHISOVER100000INTOTALFMINGACOLLECTIONCELLMOLECULARBIOLOGYUNDERHUMANPERSPECTIVEBIOLOGICALTEXTBOOKSPRESENTFEATURESOFENGLISHFSCIENCETECHNOLOGYESTCONCERNINGBIOLOGYASWELLASTHATOFTEXTBOOKACCDINGTOVERMEERTHEPURPOSEOFTRANSLATIONDETERMINESTHESTRATEGIESWHICHINTHISPROJECTMEANSTHATTRANSLATIONSHOULDFULFILLTHEGOALOFESTTEXTACCURATECONCISEDELIVERYOFKNOWLEDGETHATOFTEXTBOOKSREADABLEACCURATEINSTRUCTIONACCDINGTOAIMSOFTHESOURCETEXTTRANSLATIONSTRATEGIESHAVEBEENANALYZEDFROMTHREEDIMENSIONSTERMINOLOGYSENTENCETEXTOFFIGUREILLUSTRATIONINTHISPAPERTHEAUTHPROPOSESSOLUTIONSFFIGURINGOUTTHEPRECISEMEANINGSOFTHREETYPESOFTERMINOLOGYDIFFICULTTOTRANSLATETHEAUTHALSOOFFERSSTRATEGIESTODEALWITHDEFINITIONSENTENCESNOMINALIZEDSTRUCTURESPASSIVESENTENCESWHICHARECONDUCIVETOREPRODUCETHEUNDERLYINGLOGICOFSENTENCESPRESENTMEANINGSWITHREADERACCEPTABLEEXPRESSIONSMEANWHILEMETHODOLOGIESTOTRANSLATEDEIONPROCESSINFIGUREILLUSTRATIONAREPRESENTEDINTHEPAPERBY

簡(jiǎn)介：密級(jí)分類(lèi)號(hào)學(xué)校代碼10075學(xué)號(hào)20111139理學(xué)碩士學(xué)位論文二氧化鈰及摻銪四氟釔鈉納米顆粒對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)研究學(xué)位申請(qǐng)人陳士柱指導(dǎo)教師王書(shū)香教授張金超教授學(xué)位類(lèi)別理學(xué)碩士學(xué)科專(zhuān)業(yè)有機(jī)化學(xué)授予單位河北大學(xué)答辯日期二〇一四年六月河北大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研宄成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)的研宄成果，也不包含為獲得河北大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)所使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研宄所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了致謝。作者簽名_日期今年月2日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解河北大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查鬩和借閱。學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本學(xué)位論文屬于1、保密□，在年______月______日解密后適用本授權(quán)聲明。2、不保密4。請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方格內(nèi)打“V”

簡(jiǎn)介：研究目的用等離子噴涂的方法對(duì)鈦及鈦合金表面進(jìn)行改性以提高植入體與骨組織整合的能力的研究是目前骨科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。羥基磷灰石涂層（HA）是目前研究的熱點(diǎn)，且已應(yīng)用于臨床。但由于HA的易降解性及與鈦基體結(jié)合強(qiáng)度不高等原因?qū)е屡R床長(zhǎng)期效果欠佳。因此，目前研究的重點(diǎn)在于探索一種具有優(yōu)越的生物活性、化學(xué)穩(wěn)定性好及結(jié)合強(qiáng)度高的生物涂層材料。本研究制備了一種鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷涂層，然后對(duì)該材料的成骨細(xì)胞相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)，并進(jìn)一步檢測(cè)該涂層材料對(duì)MC3T3E1細(xì)胞粘附、增殖、分化及鈣化的生物學(xué)影響。為進(jìn)一步探討其作為新型骨植入體材料在臨床骨科中的應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法以硝酸鈣、硝酸鋅及正硅酸乙酯為原料，采用溶膠凝膠法制備鋅修飾硅酸鈣陶瓷粉體，根據(jù)特定參數(shù)采用大氣等離子噴涂系統(tǒng)（APS）進(jìn)行等離子噴涂獲得鋅修飾的硅酸鈣陶瓷涂層。通過(guò)X線(xiàn)衍射（XRD）、掃描電鏡（SEM）等觀(guān)察制備好的原材料粉末及涂層材料并進(jìn)行物相分析及觀(guān)察涂層表面形貌及特征；根據(jù)細(xì)胞毒性試驗(yàn)評(píng)價(jià)材料的生物安全性；將MC3T3E1細(xì)胞分別接種在三組材料（鋅修飾硅酸鈣涂層、硅酸鈣涂層及未涂層純鈦金屬片）上進(jìn)行培養(yǎng)4、8、12H，然后觀(guān)察各組材料對(duì)細(xì)胞的粘附影響，培養(yǎng)24H后用掃描電鏡（SEM）觀(guān)察細(xì)胞的粘附及伸展情況；材料對(duì)MC3T3E1增殖能力的影響是在細(xì)胞與各組材料共培養(yǎng)1、4、7、14D后采用MTT法及共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)；材料對(duì)MC3T3E1細(xì)胞分化功能的影響采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ENZYMELINKEDIMMUNOSBENTASSAYELISA）檢測(cè)ALP、COLI及BGP的表達(dá)，并通過(guò)茜素紅染色的方法觀(guān)察材料對(duì)成骨細(xì)胞鈣化的影響。結(jié)果1、鋅修飾硅酸鈣生物陶瓷材料的成份是以CA2ZNSI2O7為主及少量的CA2SIO4與CASIO3的生物陶瓷，該材料的原始粉體與等離子涂層后色組成成份無(wú)明顯改變；SEM觀(guān)察該涂層表面較粗糙，凹凸不平，顆粒大小約60120UM；ICP結(jié)果顯示該材料能釋放鈣離子（9660±637PPM）、硅離子（3903±629PPM）及鋅離子（905±079PPM），并具有比硅酸鈣涂層更好的化學(xué)穩(wěn)定性；細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)顯示鋅修飾的硅酸鈣陶瓷涂層材料無(wú)毒性，生物相容性好。2、鋅修飾硅酸鈣涂層材料具有比硅酸鈣涂層及未涂層純鈦金屬片更好的粘附（P＜005）及支持細(xì)胞伸展的能力；能明顯促進(jìn)MC3T3E1細(xì)胞的早期粘附、增殖以及晚期增殖的作用（P＜005）；MC3T3E1細(xì)胞在鋅修飾硅酸鈣涂層材料上的增值率及粘附率高于硅酸鈣涂層材料，說(shuō)明鋅離子的存在更有利于細(xì)胞的粘附與增殖，具有更好的細(xì)胞相容性。3、鋅修飾硅酸鈣陶瓷涂層材料能促進(jìn)、增強(qiáng)堿性磷酸酶（ALP）的活性（P＜005）及I型膠原（COLI）、骨鈣素（BGP）早期與晚期合成（P＜005）；能促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期鈣化；具有比硅酸鈣涂層更好的分化及鈣化能力。結(jié)論鋅修飾硅酸鈣陶瓷涂層細(xì)胞相容性好，具有促進(jìn)MC3T3E1細(xì)胞的粘附、增殖、分化及鈣化的能力。該涂層材料具有作為新型理想植入體材料的潛力，在臨床骨科中的應(yīng)用具有廣闊的前景。

簡(jiǎn)介：背景葡萄糖類(lèi)似物18F氟代脫氧葡萄糖18FLABELED2FLUO2DEOXYDGLUCOSE，18FFDG是目前臨床上應(yīng)用最廣泛、不可替代的腫瘤葡萄糖代謝型的PET顯像劑。然而18FFDG在以葡萄糖代謝為能量底物的腦腫瘤顯像、腫瘤與炎癥的鑒別診斷等方面的臨床應(yīng)用中仍存在一些局限性，為了提高診斷的靈敏度和特異性，課題組前期已經(jīng)成功合成了一種新型糖胺類(lèi)分子探針18F氟代脫氧葡糖對(duì)氨基苯丙氨酸胺18FFDGLYNHPHE作為新的顯像劑用于腫瘤多重代謝PET顯像研究，理論上可以與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體均特異性結(jié)合，即具有雙重靶向性。本研究將進(jìn)一步對(duì)新探針的生物學(xué)特性進(jìn)行探索。目的1體外細(xì)胞水平觀(guān)察分子探針18FFDGLYNHPHE的攝取特性并與18FFDG進(jìn)行初步比較；探討新探針的攝取機(jī)制，明確該分子探針的雙靶向性、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)通道的驗(yàn)證以及是否參與蛋白質(zhì)的合成。2活體動(dòng)物模型水平研究分子探針18FFDGLYNHPHE在模型昆明鼠體內(nèi)的生物分布及PETCT顯像特點(diǎn)，并與18FFDG的PETCT圖像結(jié)果比較。方法本研究分兩大部分，第一部分為體外細(xì)胞水平。主要包括3項(xiàng)研究1細(xì)胞攝取特性的研究測(cè)定不同共培養(yǎng)時(shí)間下，18FFDG及18FFDGLYNHPHE在HEP2細(xì)胞的攝取及洗脫率，評(píng)價(jià)新型分子探針與18FFDG的差異及相似性。2細(xì)胞攝取機(jī)制探討通過(guò)單獨(dú)及同時(shí)封閉潛在轉(zhuǎn)運(yùn)通道驗(yàn)證18FFDGLYNHPHE是否具有雙靶向性，并明確氨基酸主導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑通道。3分子探針18FFDGLYNHPHE體外穩(wěn)定性以及脂溶性。第二部分研究?jī)?nèi)容主要是完成活體內(nèi)不同模型小鼠的PETCT顯像，初步評(píng)價(jià)圖像特征，與18FFDGPETCT顯像結(jié)果進(jìn)行比較并進(jìn)行生物學(xué)分布特征檢測(cè)。結(jié)果1喉癌HEP2細(xì)胞在80MIN攝取18FFDGLYNHPHE達(dá)到最大攝取率為933±019％，較18FFDG攝取率低。218FFDGLYNHPHE與HEP2共培養(yǎng)，分別加入2DG和或苯丙氨酸，當(dāng)2DG濃度為100ΜM時(shí)，對(duì)18FFDGLYNHPHE的抑制率為4566±192，當(dāng)2DG濃度增加（200ΜM及300ΜM），2DG對(duì)18FFDGLYNHPHE的抑制率并未顯著增加，表明100ΜM的2DG已達(dá)到抑制平衡；苯丙氨酸對(duì)18FFDGLYNHPHE的抑制率隨著苯丙氨酸濃度的增加而加大，當(dāng)苯丙氨酸濃度為300ΜM時(shí)，對(duì)18FFDGLYNHPHE的抑制率為7677±549；當(dāng)2DG與苯丙氨酸一同存在于HEP2細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境時(shí)，隨著2DG與苯丙氨酸濃度的增加（100ΜM，200ΜM及300ΜM），對(duì)喉癌HEP2細(xì)胞攝取18FFDGLYNHPHE的抑制率增上升，分別為6961±567，7343±214，7925±233。3在100ΜM2DG封閉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)通道的含NA的PBS體系中，分別加入三種不同的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體抑制劑（BCH，MEAIB，絲氨酸）后，對(duì)18FFDGLYNHPHE的抑制率分別為7695±770；6953±266；7619±072。而在不含NA的膽堿體系中，并沒(méi)有明顯抑制。證實(shí)18FFDGLYNHPHE的攝取主要通過(guò)NA依賴(lài)型B0系統(tǒng)，A系統(tǒng)，系統(tǒng)。4腫瘤炎癥比率18FFDGLYNHPHE456±13118FFDG124±016；P＜005。表明18FFDGLYNHPHE對(duì)腫瘤有較高的特異性。5在體內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)S180腫瘤模型小鼠的PETCT顯像結(jié)果表明2DG或苯丙氨酸及2DG苯丙氨酸均使腫瘤部位幾乎不顯影，體內(nèi)證實(shí)新探針具有雙重代謝途徑。結(jié)論118FFDGLYNHPHE新型分子探針體外穩(wěn)定性極佳，且為水溶性。218FFDGLYNHPHE的體外實(shí)驗(yàn)表明該探針具有腫瘤相對(duì)特異靶向性，且為雙靶向性，即可以同時(shí)特異性靶向細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。3在氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中，18FFDGLYNHPHE通過(guò)NA依賴(lài)型B0系統(tǒng)，A系統(tǒng)，系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)胞。且18FFDGLYNHPHE只涉及氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，幾乎不參與蛋白質(zhì)的合成。4在體外實(shí)驗(yàn)S180腫瘤炎癥模型小鼠的PET圖像已經(jīng)證實(shí)雖然18FFDGLYNHPHE在炎癥和腦中攝取顯著低于18FFDG，但腫瘤攝取高于炎癥，有利于鑒別腫瘤與炎癥。5結(jié)合體內(nèi)及體外競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，支持18FFDGLYNHPHE是雙通道腫瘤代謝顯像分子探針，具有很好的臨床潛在應(yīng)用前景。本課題為國(guó)家自然科學(xué)基金“新型代謝類(lèi)多靶向PET分子探針研制及其在腫瘤代謝顯像中的應(yīng)用研究”（編號(hào)81471695）。

簡(jiǎn)介：異基因造血干細(xì)胞移植ALLOGENEICHEMOTOICSTEMCELLTRANSPLANTATION，ALLOHSCT是治療各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤、重型再生障礙性貧血及重癥地中海貧血等的有效治療方法，但移植相關(guān)并發(fā)癥仍是威脅患者生命的重要因素，其中移植物抗宿主病GRAFTVERSUSHOSTDISEASE，GVHD是移植后最嚴(yán)重最棘手的并發(fā)癥之一，急性移植物抗宿主病AGVHD是移植后患者非復(fù)發(fā)死亡的主要原因，其發(fā)生必須具備三個(gè)前提①移植物中含有足夠數(shù)量的識(shí)別和攻擊宿主異源性抗原的免疫活性細(xì)胞②宿主應(yīng)有與移植物不同的同種異體抗原③宿主處于免疫無(wú)能狀態(tài)，對(duì)移植物不產(chǎn)生排斥。目前根據(jù)GVHD發(fā)病機(jī)制的不同，各種抗GVHD的化學(xué)藥物在臨床上廣泛應(yīng)用，如人抗胸腺球蛋白ANTIHUMANTHYMOCYTEGLOBULIN，ATG、抗TNF抗體英夫利昔、環(huán)孢素ACSA、他克莫司FK506等，但這些非特異性免疫抑制藥物本身具有毒副作用且易導(dǎo)致病毒及真菌等感染，從而影響療效。如何降低ALLOHSCT患者移植相關(guān)死亡率、提高患者生存率及生存質(zhì)量，是目前臨床工作面臨的挑戰(zhàn)。間充質(zhì)干細(xì)胞MESENCHYMALSTEMCELL，MSC作為中胚層來(lái)源的具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，MSC在體外可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能。且MSC具有造血支持、低免疫原性、免疫抑制及無(wú)致瘤性等特點(diǎn)，近年來(lái)，隨著細(xì)胞替代治療與組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，MSC已被應(yīng)用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、阿爾茲海默病、心血管疾病等多種疾病的治療研究，在血液學(xué)方面，已被應(yīng)用于GVHD的預(yù)防和治療。目前骨髓仍是MSC的主要來(lái)源，在血液系統(tǒng)疾病方面，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANBONEMARROWMESENCHYMALSTEMCELL，HBMSC已被應(yīng)用于臨床治療GVHD，但成人HBMSC細(xì)胞數(shù)量極少，并且增殖分化潛能隨年齡的增大而下降，病毒感染率較高，供者HBMSC的采集須行有創(chuàng)性骨髓穿刺，亦使其來(lái)源受到限制。引起AGVHD發(fā)生、發(fā)展的主要細(xì)胞為免疫活性細(xì)胞，即供者來(lái)源的成熟T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)的活化，可引起其一系列的反應(yīng)，繼而激活并產(chǎn)生IL2、IFNΓ、TNFΑ、IL12及其受體等。其中IL2和IFNΓ為T(mén)H1細(xì)胞因子，TH1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在遲發(fā)型超敏反應(yīng)、部分自身免疫性疾病、宿主體內(nèi)抗胞內(nèi)病原感染都起著重要作用，TH1細(xì)胞與AGVHD的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系。而我們知道，HAMSC具有免疫抑制作用，而且其低表達(dá)HLAABC和HLAG，不表達(dá)HLADR表面抗原，表現(xiàn)出低免疫源性和免疫抑制作用，且移植到動(dòng)物體內(nèi)無(wú)致瘤性，是較為理想的免疫赦免細(xì)胞，為各種疾病的細(xì)胞治療提供了新的選擇。在異基因造血干細(xì)胞移植中，如何平衡機(jī)體內(nèi)TH1TH2細(xì)胞及ⅠⅡ型細(xì)胞因子，對(duì)于預(yù)防和治療GVHD具有重要意義。由此可見(jiàn)，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可能為GVHD治療新的種子細(xì)胞，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。已有研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎存在于所有的組織器官中，且不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其體外擴(kuò)增的能力也不完全相同。已有研究報(bào)道了臍帶及胎肺來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，前者的體外擴(kuò)增能力明顯強(qiáng)于后者，前者可在傳代40多次后仍保持原有的生物學(xué)特性及增殖能力。因此，目前越來(lái)越多的研究組致力于尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞，希望能夠替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用，以解決骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題。2004年研究者首次從人羊膜分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)其從羊膜中胚層分化而來(lái)，具有向三胚層分化的多潛能性，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞HUMANAMNIOTICMESENCHYMALSTEMCELLS，HAMSC從健康產(chǎn)婦正常分娩后廢棄的胎盤(pán)組織中分離培養(yǎng)，羊膜組織來(lái)源充足，系產(chǎn)后廢棄物、不受倫理學(xué)限制，且羊膜不含有血管、神經(jīng)、肌肉等組織，分離提純過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、分離細(xì)胞純度較高。經(jīng)免疫表型鑒定，HAMSC不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原，還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原，如OCT3、OCT4、SSEA3、SSEA4等，這提示HAMSC可能還具有干細(xì)胞特性。近年來(lái)，人羊膜干細(xì)胞已經(jīng)在角膜修復(fù)、燒傷性疾病、骨科疾病、脊髓損傷等相關(guān)疾病的臨床研究和治療取得療效。那么，HAMSC與HBMSC生物學(xué)特性相似，均具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，且HAMSC可能還具有干細(xì)胞特性，細(xì)胞來(lái)源更豐富，是否可成為HBMSC的替代治療用于GVHD的預(yù)防和治療呢目的本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)HAMSC和HBMSC生物學(xué)特性及對(duì)異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較，希望為HAMSC治療GVHD、解決HBMSC來(lái)源不足的問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法通過(guò)酶消化法從健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的新鮮胎盤(pán)羊膜中分離培養(yǎng)HAMSC，通過(guò)密度梯度離心法從健康供者志愿捐獻(xiàn)的骨髓中分離培養(yǎng)HBMSC。實(shí)驗(yàn)分為兩部分第一部分實(shí)驗(yàn)為HAMSC與HBMSC生物學(xué)特性的比較，分別培養(yǎng)相同傳代代數(shù)的人羊膜來(lái)源與骨髓來(lái)源的MSC，對(duì)二者進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察，通過(guò)CCK8法檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖情況并生長(zhǎng)曲線(xiàn)繪制，對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，采用流式免疫分型技術(shù)分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞的波形蛋白VIMENTIN第二部分實(shí)驗(yàn)為HAMSC和HBMSC對(duì)異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較，經(jīng)絲裂霉素處理后的HAMSC與HBMSC分別與植物血凝集素PHYTOHEMAGGLUTININ，PHA刺激的異體人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分別建立MSC與異體人外周血單個(gè)核細(xì)胞PBMC共培養(yǎng)體系，采用CCK8法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞的增殖情況，采用ELISA法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子干擾素ΓIFNΓ的分泌水平。結(jié)果1HAMSC與HBMSC細(xì)胞形態(tài)相似，HAMSC可傳至15代以上，HBMSC傳至第67代細(xì)胞后，開(kāi)始老化、生長(zhǎng)增殖能力明顯減弱2在細(xì)胞周期的比較中，HAMSC與HBMSC二者的G2M期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＞0053細(xì)胞免疫表型鑒定，HAMSC和HBMSC細(xì)胞表面均表達(dá)CD105、CD90、CD73，均不表達(dá)CD34、CD45、CD11B、CD19、HLADR，HAMSC表達(dá)OCT34，而HBMSC不表達(dá)OCT344免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，HAMSC與HBMSC均表達(dá)VIMENTIN5HAMSC和HBMSC均對(duì)PHA刺激的PBMC增殖具有抑制作用，且隨著HAMSC和HBMSC細(xì)胞比例的增高，抑制能力增強(qiáng)，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異P＞0056ELISA結(jié)果提示，HAMSCPBMCPHA共培養(yǎng)組上清中IFNΓ水平較HBMSCPHAPBMC組低P0056，而HAMSCPBMCPHA共培養(yǎng)組及HBMSCPHAPBMC共培養(yǎng)組分別與PBMCPHA組上清比較，IFNΓ水平明顯降低P＜005。結(jié)論HAMSC比HBMSC具有更強(qiáng)的增殖能力和干細(xì)胞特性，二者均有免疫抑制功能，HAMSC與HBMSC在體外均能抑制PHA刺激的異體淋巴細(xì)胞增殖并減少其IFNΓ的分泌。

簡(jiǎn)介：人白細(xì)胞介素1ΑHIL1Α在抗腫瘤等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，重組HIL1ΑRHIL1Α表達(dá)主要是通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，但大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)存在蛋白分離純化工藝復(fù)雜等缺點(diǎn)。酵母表達(dá)系統(tǒng)具有蛋白表達(dá)后修飾及分離純化工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，本文構(gòu)建了RHIL1Α畢赤酵母工程菌，挑選表達(dá)量高的菌株，在1L搖瓶和3L發(fā)酵罐規(guī)模下進(jìn)行了表達(dá)條件的優(yōu)化，在10L和50L發(fā)酵罐規(guī)模進(jìn)行了樣品的獲取、產(chǎn)物純化工藝以及初步的活性研究。為RHIL1Α的產(chǎn)業(yè)化研究奠定了基礎(chǔ)。主要研究包括1、本研究對(duì)HIL1Α的CDNA序列進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化，采用PPICZΑA作為目的基因的表達(dá)載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)化法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至X33畢赤酵母。通過(guò)基因組PCR鑒定，MM和MD平板篩選，SDSPAGE鑒定等方法篩選得到高表達(dá)且遺傳穩(wěn)定的RHIL1Α工程菌。2、在1L搖瓶規(guī)模下對(duì)RHIL1Α工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在PH55、26℃、甲醇濃度025％條件下，RHIL1Α的表達(dá)量最高19MGL。3、在3L發(fā)酵罐規(guī)模下對(duì)RHIL1Α工程菌的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，在PH55、26℃、甲醇濃度025％條件下，RHIL1Α的表達(dá)量最高180MGL。4、擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模獲取樣品。在PH55、26℃、甲醇濃度025％條件下，10L和50L發(fā)酵罐中的表達(dá)量分為251MGL和307MGL。5、對(duì)RHIL1Α的分離純化條件進(jìn)行摸索。通過(guò)高速低溫離心、雙水相、超濾以及DEAE陰離子交換層析處理后，獲得了純度高于90％，收率大于50％的目的蛋白。6、采用MTT法檢測(cè)RHIL1Α對(duì)人肝癌細(xì)胞BEL7402的作用并證明RHIL1Α能夠抑制人肝癌細(xì)胞7402的增殖。為進(jìn)一步研究RHIL1Α對(duì)腫瘤的臨床治療奠定了理論基礎(chǔ)。

簡(jiǎn)介：熒光分子探針具有特異性、專(zhuān)一性、靈敏性、快速便捷以及可視化等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)逐漸在環(huán)境監(jiān)測(cè)、生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷等領(lǐng)域得到重視。尤其是在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，人們對(duì)于應(yīng)用熒光探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化以及實(shí)現(xiàn)腫瘤的可視化診斷越來(lái)越有興趣。細(xì)胞內(nèi)或腫瘤內(nèi)環(huán)境具有特殊的性質(zhì)，如溶酶體的PH要比其他細(xì)胞內(nèi)囊泡的PH更低，腫瘤的PH比正常組織更低。利用這一性質(zhì)可以為腫瘤的早期診斷提供思路。本文總結(jié)了現(xiàn)有的研究成果，設(shè)計(jì)了新的酸敏感的熒光分子探針R6GEDA，基于該探針設(shè)計(jì)了一系列測(cè)定胞內(nèi)酸度的納米顆粒，并研究了酸敏感納米顆粒在腫瘤診斷中的應(yīng)用。一、基于羅丹明衍生物“開(kāi)關(guān)環(huán)”機(jī)理的酸敏感探針R6GEDA設(shè)計(jì)了以羅丹明內(nèi)酰胺INTRALACTAM的“開(kāi)關(guān)環(huán)”O(jiān)PENCLOSEDRING機(jī)理為基礎(chǔ)的酸敏感探針R6GEDA。該探針利用羅丹明這類(lèi)熒光分子具有酸響應(yīng)的內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)“開(kāi)關(guān)環(huán)”機(jī)理，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶酶體酸度的高靈敏響應(yīng)。該探針具有低背景，高亮度，抗淬滅，良好的生物兼容性，長(zhǎng)時(shí)間保留等優(yōu)點(diǎn)，是一類(lèi)有前景的溶酶體酸性探針，有希望在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用。二、基于羅丹明內(nèi)酰胺的雙色二氧化硅熒光納米顆粒設(shè)計(jì)了基于羅丹明內(nèi)酰胺為響應(yīng)發(fā)光團(tuán)，偶聯(lián)有高亮度的熒光分子熒光素FITC作為內(nèi)參，以二氧化硅為載體的雙色熒光納米顆粒，可以實(shí)現(xiàn)溶酶體內(nèi)酸度的高靈敏的比率測(cè)定。二氧化硅納米顆粒具有良好的生物兼容性，該熒光納米顆粒可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸度的測(cè)定，基于該探針我們用流式細(xì)胞儀的方法測(cè)定了在細(xì)胞凋亡APOTOSIS過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)溶酶體酸度的變化。三、羅丹明偶聯(lián)丹磺酰氯的比率型熒光分子探針LYSODR設(shè)計(jì)了基于丹磺酰氯DANSYL共價(jià)偶聯(lián)酸敏感的羅丹明R6GEDA的比率型熒光小分子探針LYSODR，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)酸性囊泡的PH精確測(cè)定。以丹磺酰氯為內(nèi)參，通過(guò)測(cè)定羅丹明發(fā)光團(tuán)對(duì)酸度的響應(yīng)，從而精確測(cè)定囊泡的酸度。該探針可以精確測(cè)定細(xì)胞內(nèi)單個(gè)溶酶體的酸度變化。利用該探針我們探索了HELA細(xì)胞和L929細(xì)胞的酸度差異，證實(shí)了腫瘤細(xì)胞酸性強(qiáng)于正常細(xì)胞的事實(shí)，并用于比較細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死時(shí)細(xì)胞酸度的差異，證明了細(xì)胞凋亡時(shí)PH要高于細(xì)胞壞死時(shí)，這是首次基于圖像法得到的比較凋亡和壞死這兩種重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究。四、偶聯(lián)有羅丹明內(nèi)酰胺的聚苯乙烯馬來(lái)酸酐高分子納米在腫瘤成像中的研究設(shè)計(jì)了偶聯(lián)有酸敏感的脫氧羅丹明內(nèi)酰胺（RHODAMINDEOXYLACTAM）的聚苯乙烯馬來(lái)酸酐高分子，實(shí)現(xiàn)小鼠體內(nèi)腫瘤組織的成像。我們發(fā)展了一個(gè)比之前工作報(bào)道的羅丹明內(nèi)酰胺R6GEDA更優(yōu)良的探針脫氧羅丹明內(nèi)酰胺RHODAMINDEOXYLACTAM，DRBEDA，該探針具有亮度更高，對(duì)酸更加敏感等優(yōu)點(diǎn)。將此探針偶聯(lián)在生物兼容性良好的聚苯乙烯馬來(lái)酸酐高分子上，利用生物體內(nèi)腫瘤血管的EPRENHANCEDPERMEABILITYRETENTION效應(yīng)，以及腫瘤細(xì)胞比正常組織更酸等特性，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的特異性聚集和低背景成像。該高分子具有特異性、低背景、良好的生物兼容性、較長(zhǎng)的保留時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，有望在腫瘤成像中發(fā)揮作用。五、基于羅丹明脫氧內(nèi)酰胺檢測(cè)細(xì)胞表面的唾液酸細(xì)胞膜表面唾液酸具有多種生物學(xué)功能，如免疫、信號(hào)傳遞等，研究細(xì)胞膜表面的唾液酸一直是研究的熱點(diǎn)。設(shè)計(jì)了對(duì)醛基靈敏的脫氧內(nèi)酰胺羅丹明DRBEDA，可以有效監(jiān)測(cè)細(xì)胞表明的唾液酸。和傳統(tǒng)唾液酸監(jiān)測(cè)方法不同的是，DRBEDA只有在和醛基反應(yīng)后，脫氧內(nèi)酰胺的環(huán)打開(kāi)才會(huì)有熒光，因而具有低背景、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

簡(jiǎn)介：細(xì)胞遷移是一個(gè)多步性、周期性的生理和化學(xué)過(guò)程，包括突出物的伸展、突出物前緣附近粘附物的形成、細(xì)胞體向前移動(dòng)、粘附因子的釋放和細(xì)胞后方的撤回等過(guò)程。在生理過(guò)程和病理過(guò)程中，尤其腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中是一個(gè)關(guān)鍵的細(xì)胞功能。為此，近年來(lái)國(guó)內(nèi)外在細(xì)胞遷移方面已經(jīng)做了大量的研究。然而，大量的研究方法仍然停留在傳統(tǒng)的方法上，未能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞遷移過(guò)程中產(chǎn)生的重要生物化學(xué)分子進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。本工作中，首次制作了一種集成電化學(xué)傳感器的細(xì)胞遷移小室微器件，實(shí)時(shí)靈定量檢測(cè)細(xì)胞遷移過(guò)程中釋放的生物化學(xué)分子，并探究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的作用。該器件包含了兩部分電化學(xué)生物傳感器和細(xì)胞遷移室，這種雙模塊細(xì)胞遷移平臺(tái)能夠同時(shí)實(shí)時(shí)研究細(xì)胞分泌物和細(xì)胞功能，檢測(cè)生物化學(xué)分子進(jìn)而分析探討細(xì)胞活動(dòng)性和細(xì)胞遷移的可能性機(jī)理。檢測(cè)的生物化學(xué)分子包括活性氧（過(guò)氧化氫，H2O2）和細(xì)胞因子（干擾素Γ。IFNΓ），通過(guò)記錄分析相應(yīng)的數(shù)據(jù)來(lái)探討過(guò)氧化氫的產(chǎn)生與腫瘤細(xì)胞遷移的相關(guān)性，體外評(píng)估抗腫瘤免疫水平。該器件為生物醫(yī)學(xué)研究細(xì)胞功能提供了一種新型的方法，解決了實(shí)時(shí)檢測(cè)生物分子這一問(wèn)題。本論文的主要工作和結(jié)果歸納如下1構(gòu)建細(xì)胞遷移小室微器件實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中釋放的H2O2本工作中，合成多層碳納米管石墨烯二氧化錳納米復(fù)合物，并用于功能化修飾電極以檢測(cè)在生長(zhǎng)因子濃度梯度誘導(dǎo)下腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中所產(chǎn)生、釋放的過(guò)氧化氫。研究的腫瘤細(xì)胞包括黑色素瘤A375細(xì)胞、喉癌HEP2細(xì)胞和肝癌HEPG2細(xì)胞。在生長(zhǎng)因子趨向性的情況下檢測(cè)到A375、HEP2和HEPG2細(xì)胞釋放過(guò)氧化氫的最高濃度分別是130±13NM70±07NM和63±07NM。相應(yīng)的細(xì)胞遷移率為98±6％、38±4和32±3。該工作首次實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)分析腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中過(guò)氧化氫的動(dòng)態(tài)水平變化，利用極少樣品，監(jiān)控H2O2的釋放及變化量，探討細(xì)胞活動(dòng)性并分析細(xì)胞遷移的可能性機(jī)理。2檢測(cè)免疫細(xì)胞在腫瘤抗原刺激下釋放的IFNΓ應(yīng)用設(shè)計(jì)的雙模型器件檢測(cè)免疫細(xì)胞釋放的IFNΓ，研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的作用，體外評(píng)估抗腫瘤免疫水平。應(yīng)用適配體傳感器對(duì)IFNΓ靈敏性檢測(cè)LOD245PGML，定量檢測(cè)人類(lèi)急性白血病單核細(xì)胞THP1和巨噬細(xì)胞RAW2647在脂多糖LPS和肝癌細(xì)胞HEPG2的刺激下產(chǎn)生的IFNΓ。研究發(fā)現(xiàn)，免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)比脂多糖LPS刺激其釋放的IFNΓ濃度更高。另外，應(yīng)用雙模型裝置實(shí)時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞遷移過(guò)程中與免疫細(xì)胞作用，釋放IFNΓ的量。該工作證實(shí)腫瘤細(xì)胞作為腫瘤抗原，使人類(lèi)急性白血病單核細(xì)胞THP1和巨噬細(xì)胞RAW2647活化，釋放IFNΓ。綜上所述。H2O2傳感和IFNΓ適配體傳感的電化學(xué)性能優(yōu)良，可實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞遷移過(guò)程中釋放的小分子、隨時(shí)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞作用產(chǎn)生的干擾素。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在細(xì)胞遷移過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化氫，采用所需樣品量少的雙模型器件，通過(guò)細(xì)胞遷移平臺(tái)同時(shí)研究了過(guò)氧化氫的產(chǎn)生和細(xì)胞功能。采用雙模型器件研究腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)免疫細(xì)胞釋放的干擾素。研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞作為腫瘤抗原，使免疫細(xì)胞活化，釋放IFNΓ。

簡(jiǎn)介：白細(xì)胞介素1Β（INTERLEUKIN1Β，IL1Β）是一個(gè)重要的促炎性細(xì)胞因子，參與多種疾病的生理病理反應(yīng)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前關(guān)于人IL1Β表達(dá)的研究主要是采用原核表達(dá)系統(tǒng)，由于大腸桿菌表達(dá)重組蛋白表達(dá)量低、存在內(nèi)毒素、分離純化復(fù)雜、蛋白回收率低等缺點(diǎn)，因此，本文選用真核表達(dá)系統(tǒng)即巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)人IL1Β蛋白，達(dá)到提高蛋白產(chǎn)量和回收率的目的。本文首先根據(jù)編碼人IL1Β的MRNA序列，利用在線(xiàn)優(yōu)化工具對(duì)其基因序列進(jìn)行優(yōu)化，然后分別導(dǎo)入畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9、PPIC9K和PPICZΑA，成功構(gòu)建人IL1Β重組載體，并將其轉(zhuǎn)染至畢赤酵母菌GS115、SMD1168和X33，從重組畢赤酵母菌中篩選得到正確且高效表達(dá)的工程菌株，然后進(jìn)一步探討其3L規(guī)模的發(fā)酵條件、產(chǎn)物純化工藝及鑒定其生物學(xué)作用。本文首先對(duì)重組表達(dá)載體PPIC9HIL1Β、PPIC9KHIL1Β和PPICZΑAHIL1Β進(jìn)行鑒定，并將其電轉(zhuǎn)化整合到畢赤酵母受體菌GS115、SMD1168和X33的基因組中，涂布在MD和YPDZ平板，待長(zhǎng)出單克隆后，用基因組PCR鑒定來(lái)篩選陽(yáng)性克隆，然后通過(guò)BMGY培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)5天，進(jìn)行SDSPAGE和WESTERNBLOT蛋白鑒定，最終篩選出可正確高效表達(dá)的重組菌株X33PPICZΑAHIL1Β。本文在3L發(fā)酵罐規(guī)模下，通過(guò)研究誘導(dǎo)階段中不同的起始誘導(dǎo)菌體密度OD、溫度、PH、溶解氧體積分?jǐn)?shù)DO和甲醇濃度及誘導(dǎo)時(shí)間五個(gè)因素對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)和目的蛋白表達(dá)影響，從而確定出最佳誘導(dǎo)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，X33PPICZΑAHIL1Β工程菌株在3L發(fā)酵規(guī)模下，最佳誘導(dǎo)條件為起始誘導(dǎo)菌體密度OD600為600，溫度26℃，PH為50，溶氧體積分?jǐn)?shù)20％，甲醇濃度025％，誘導(dǎo)3天，RHIL1Β的表達(dá)量最高，可達(dá)280MGL。本文對(duì)RHIL1Β分離純化方法進(jìn)行了初步研究，研究結(jié)果顯示，首先采用低溫離心法去除大部分菌體，然后用磷酸氫二鉀無(wú)水乙醇雙水相體系對(duì)收集的發(fā)酵液上清進(jìn)行抽提，收集上相溶液，經(jīng)10KD超濾、濃縮，最后經(jīng)DEAE弱陰離子交換層析分離純化方法，可以得到純度在95％左右，收率75％的RHIL1Β。本文分別采用MTT法和HOECHST33258染色法對(duì)獲得的重組蛋白進(jìn)行初步的生物學(xué)活性檢測(cè)，MTT法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，RHIL1Β對(duì)人肝癌細(xì)胞株HEPG2和小鼠黑素瘤細(xì)胞株B16具有增殖抑制作用，通過(guò)顯微鏡觀(guān)察RHIL1Β處理過(guò)的HEPG2和B16細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，RHIL1Β可促進(jìn)上述兩種癌細(xì)胞的凋亡。綜上所述，本文為RHIL1Β的工業(yè)化生產(chǎn)及研究其生物學(xué)作用奠定基礎(chǔ)，也為研發(fā)抗腫瘤新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：目的探討靜磁場(chǎng)SMF作用下金屬離子對(duì)成骨細(xì)胞生物活性的影響為防治假體周?chē)鸁o(wú)菌性松動(dòng)提供一定的理論依據(jù)。方法將COCL2粉末與CRCL3粉末溶于無(wú)菌雙蒸水配制成COCL2和CRCL3金屬離子混合溶液將金屬離子CO2、CR3混合溶液與小鼠顱骨成骨細(xì)胞MC3T3E1共培養(yǎng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組加載不同磁場(chǎng)強(qiáng)度1、10、100MT。實(shí)驗(yàn)分為CO2CR3組對(duì)照組；CO2、CR31MTCO2、CR310MTCO2、CR3100MT。掃描電鏡檢測(cè)成骨細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)。MTT法檢測(cè)成骨細(xì)胞活力。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布。酶聯(lián)免疫分析ELISA法對(duì)培養(yǎng)上清液ALP堿性磷酸酶含量進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果靜磁場(chǎng)作用下的成骨細(xì)胞呈現(xiàn)更加成熟的形態(tài)學(xué)特征CO2、CR3金屬離子對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3的毒性明顯降低；同時(shí)G2M分裂期分布比例明顯增加細(xì)胞停滯在G0G1休眠期的比率明顯減少；與對(duì)照組相比不同場(chǎng)強(qiáng)磁場(chǎng)加載后成骨細(xì)胞堿性磷酸酶分泌明顯增強(qiáng)P結(jié)論靜磁場(chǎng)作用下CO2、CR3金屬離子對(duì)成骨細(xì)胞的毒性作用會(huì)明顯減低為磁場(chǎng)療法防治假體周?chē)侨芙馓峁┝藢?shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：研究背景骨質(zhì)疏松癥是中老年人群的常見(jiàn)病以全身骨量減少骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)破壞骨強(qiáng)度降低和骨折危險(xiǎn)性增高為特征。骨質(zhì)疏松癥最大的危害是骨質(zhì)疏松性骨折其中以髖部骨折危害最大不僅髖部活動(dòng)功能損傷明顯而且死亡率高。隨著老齡化社會(huì)的到來(lái)骨質(zhì)疏松癥防治的臨床與基礎(chǔ)研究已成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。運(yùn)動(dòng)是預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的重要因素。近年來(lái)具有無(wú)創(chuàng)、副反應(yīng)小、依從性好等特點(diǎn)的物理因子療法防治骨質(zhì)疏松癥逐漸受到重視。全身振動(dòng)運(yùn)動(dòng)是振動(dòng)療法中的一種是指借助于振動(dòng)儀器使振動(dòng)刺激通過(guò)下肢或軀干作用于全身使機(jī)體整體振動(dòng)以達(dá)到防治疾病目的的方法。對(duì)去卵巢模型動(dòng)物、低骨量人群及絕經(jīng)后女性的研究顯示低于引起組織損傷的機(jī)械振動(dòng)信號(hào)低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LOWMAGNITUDEHIGHFREQUENCYVIBRALLIONLMHFV具有較好的增加骨形成和抑制骨吸收作用。作為一種治療骨質(zhì)疏松癥的新方法LMHFV具有無(wú)創(chuàng)、副反應(yīng)小、高依從性的特點(diǎn)能降低骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生率在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療領(lǐng)域越來(lái)越受到重視。但是LMHFV增加骨形成、抑制骨吸收的具體機(jī)制仍不清楚。研究證明振動(dòng)應(yīng)力可以影響成骨細(xì)胞的生物學(xué)特性但振動(dòng)應(yīng)力影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的具體機(jī)制尚不清楚。因此研究振動(dòng)應(yīng)力影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的分子機(jī)制以其作為切入點(diǎn)進(jìn)一步闡明LMHFV預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松的機(jī)制將為全身振動(dòng)運(yùn)動(dòng)預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松提供科學(xué)依據(jù)。本研究通過(guò)自行研制的細(xì)胞振動(dòng)儀對(duì)體外培養(yǎng)的成骨前體MC3T3E1細(xì)胞施加低強(qiáng)度03G、不同高頻率0、30、45、60、90HZ振動(dòng)LMHFV結(jié)合分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)觀(guān)察LMHFV對(duì)成骨前體MC3T3E1細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其機(jī)制的初步研究。研究?jī)?nèi)容如下目的1研究低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。2研究環(huán)氧合酶2COX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用。3研究LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。方法Ⅰ低強(qiáng)度、高頻率振動(dòng)LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的作用1LMHFV影響成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的影響對(duì)MC3T3E1細(xì)胞施加頻率0、30、45、60、90HZ強(qiáng)度03G時(shí)間30MIN的振動(dòng)分別于振動(dòng)后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用酶聯(lián)免疫吸附法ELISA檢測(cè)LMHFV加載后不同時(shí)間MC3T3E1細(xì)胞分泌可溶性O(shè)PG、RANKL的情況。通過(guò)計(jì)算OPGRANKL比率將增加OPGRANKL比率最高的振動(dòng)頻率做為本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)研究的頻率。2LMHFV加載成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCM對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的影響LMHFV30HZ加載MC3T3E1細(xì)胞后含OPGRANKL比率最高的條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIAMCM30HZ及LMHFV0HZ加載后的條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIAMCM0HZ分別與含40NGMLSRANKL、20NGMLMCSF的1640培養(yǎng)基按體積比11混合形成混合培養(yǎng)基。將破骨細(xì)胞前體RAW2647細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組CM0HZ、實(shí)驗(yàn)組CM30HZ混合培養(yǎng)基分別誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體RAW2647細(xì)胞分化5、7天。①實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)REALTIMEQUANTITATIVEPCRQPCR分別檢測(cè)第5、7天各組抗酒石酸酸性磷酸酶TRAPMRNA的表達(dá)水平②TRAP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)第5、7天各組TRAP活性；③TRAP染色計(jì)算第7天各組多核破骨細(xì)胞形成數(shù)目。2LMHFV影響成骨細(xì)胞分化的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP、骨鈣素OCNMRNA表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY分別加載4、8天后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)REALTIMEQUANTITATIVEPCRQPCR檢測(cè)ALPMRNA、OCNMRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)對(duì)照分析ALPMRNA、OCNMRNA相對(duì)表達(dá)的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP活性、骨鈣素OCN表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY分別加載4、8天后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白ALP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ALP活性；OCNELISA試劑盒檢測(cè)OCN表達(dá)；ALP活性、OCN表達(dá)均以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析ALP活性、OCN表達(dá)相對(duì)改變的變化。3LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MINDAY培養(yǎng)14天后茜素紅染色觀(guān)察礦化結(jié)節(jié)形成情況。Ⅱ環(huán)氧合酶COX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞COX2MRNA及蛋白表達(dá)的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN。分別于LMHFV干預(yù)結(jié)束后0、05、15、3、6H①提取細(xì)胞總RNAQPCR法檢測(cè)COX2MRNA表達(dá)以GAPDH為內(nèi)對(duì)照分析COX2MRNA相對(duì)表達(dá)的變化；②提取細(xì)胞總蛋白WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)以ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)PGE2活性的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN。分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；在COX2特異性抑制劑NS398抑制實(shí)驗(yàn)中MC3T3E1細(xì)胞先與10ΜMNS398孵育1H再施加LMHFV刺激在LMHFV干預(yù)結(jié)束后05H分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中PGE2活性并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析PGE2活性相對(duì)表達(dá)的變化。3COX2特異性抑制劑NS398對(duì)LMHFV增加成骨細(xì)胞OPG分泌的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL0HZVEHICLE組、CONTROL0HZNS398組、LMHFV30HZVEHICLE組、LMHFV30HZNS398組。VEHICLE為溶解NS398的等量DMSOMC3T3E1細(xì)胞先與10ΜMNS398孵育1H再施加LMHFV03G30HZ30MIN刺激在LMHFV干預(yù)結(jié)束后6H分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清、提取細(xì)胞總蛋白；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中可溶性O(shè)PG活性并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析OPG分泌的變化。4COX2特異性抑制劑NS398對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化作用的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL0HZVEHICLE組、CONTROL0HZNS398組、LMHFV30HZVEHICLE組、LMHFV30HZNS398組。干預(yù)方法為對(duì)細(xì)胞施加8天的LMHFV03G30HZ30MINDAY刺激VEHICLE為溶解NS398的等量DMSO細(xì)胞與10ΜMNS398孵育8天干預(yù)結(jié)束后分別收集細(xì)胞、提取細(xì)胞總蛋白；按前述方法分別檢測(cè)ALP活性、OCN表達(dá)并以細(xì)胞總蛋白量標(biāo)準(zhǔn)化分析ALP活性、OCN表達(dá)相對(duì)改變的變化。ⅢLMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初探分別于MC3T3E1細(xì)胞施加LMHFV03G30HZ30MIN刺激前1H加入各種信號(hào)通路抑制劑NS398、STAUROSPINE、H89、U0126、SP600125、SB203580于LMHFV加載結(jié)束后3小時(shí)提取細(xì)胞總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)以ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。2CAMPPKA信號(hào)通路對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2表達(dá)的影響1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PKA信號(hào)通路的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)PKA總蛋白及磷酸化蛋白含量以總蛋白為對(duì)照分析PKA磷酸化蛋白含量相對(duì)值的變化。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響MC3T3E1細(xì)胞隨機(jī)分為CONTROL組0HZ、LMHFV組30HZCONTROL組不予振動(dòng)刺激LMHFV組給予振動(dòng)刺激03G30HZ30MIN分別于LMHFV加載結(jié)束后0、05、15、3、6H收集細(xì)胞。CAMPELISA試劑盒檢測(cè)LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。3LMHFV加載成骨細(xì)胞含PGE2條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞結(jié)束后05H分別收集0HZ、30HZ組含PGE2的條件培養(yǎng)基CMPGE2隨機(jī)將MC3T3E1細(xì)胞分為CM0HZ組、CM30HZ組與相應(yīng)的CMPGE2分別共孵育0、05、15、3、6H后收集細(xì)胞CAMPELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)CMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。4腺苷酸環(huán)化酶激活劑FSKOLINFSK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響MC3T3E1細(xì)胞與15ΜMFSK分別共孵育0、05、15、3、6H或分別與0、5、10、15、20ΜMFSK共孵育3H后按CAMPELISA檢測(cè)試劑盒要求收集細(xì)胞檢測(cè)含F(xiàn)SK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響。5PKA抑制劑對(duì)LMHFV、FSK、CMPGE2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響在MC3T3E1細(xì)胞接受各種干預(yù)因素前加入30ΜMH89孵育1H分別于LMHFV03G、30HZ、30MIN加載細(xì)胞后3H、15ΜMFSK刺激細(xì)胞后3H、CMPGE2孵育細(xì)胞后3H收集細(xì)胞提取總蛋白。WESTERNBLOT檢測(cè)COX2蛋白表達(dá)情況ΒACTIN為內(nèi)對(duì)照分析COX2蛋白相對(duì)表達(dá)的變化。結(jié)果Ⅰ低強(qiáng)度高頻率振動(dòng)LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的作用1LMHFV影響成骨細(xì)胞OPGRANKL比率的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞表達(dá)OPGRANKL比率的影響LMHFV加載結(jié)束后6H與0HZ相比30HZLMHFV能明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞分泌OPGP2LMHFV加載成骨細(xì)胞條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCM對(duì)破骨細(xì)胞分化成熟的影響LMHFV加載結(jié)束后6小時(shí)與0HZ相比30HZ形成的CM含OPGRANKL比率最高。①與含CM0HZ的混合培養(yǎng)基組相比在第5天CM30HZ組TRAPMRNA及活性均較CM0HZ組低差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0069P0160；在第7天CM30HZ組TRAPMRNA及活性均較CM0HZ組低差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P2LMHFV影響成骨細(xì)胞分化的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞堿性磷酸酶ALP、骨鈣素OCNMRNA表達(dá)的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞4天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALPMRNA水平其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0006LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞8天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALPMRNA及OCNMRNA水平其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0003P0001。2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞ALP活性、OCN表達(dá)的影響LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞4天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALP活性其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0031；LMHFV加載MC3T3E1細(xì)胞8天與0HZ組相比30HZ組增加MC3T3E1細(xì)胞ALP活性及OCN表達(dá)其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0003P0001。3LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)形成的影響生長(zhǎng)至80％90％匯合的MC3T3E1細(xì)胞經(jīng)0HZ、30HZLMHFV加載14天后茜素紅染色結(jié)果顯示0HZ組、30HZ組LMHFV均可見(jiàn)橘紅色鈣化結(jié)節(jié)但30HZ組鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目較0HZ組多顏色較0HZ組深。ⅡCOX2在LMHFV影響成骨細(xì)胞生物學(xué)特性中的作用1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞COX2MRNA及蛋白表達(dá)的影響1與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3、6H振動(dòng)組COX2MRNA表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP2與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后05、15、3、6H振動(dòng)組COX2蛋白表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PGE2活性表達(dá)的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3、6H振動(dòng)組PGE2活性表達(dá)均較CONTROL組增加ALLP3COX2特異性抑制劑對(duì)LMHFV增加成骨細(xì)胞OPG分泌的影響COX2特異性抑制劑NS398對(duì)30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后6HOPG的分泌具有抑制作用P0012NS398可抑制LMHFV誘導(dǎo)的OPGRANKL比率升高。4COX2特異性抑制劑對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化作用的影響對(duì)30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞8天COX2特異性抑制劑NS398可明顯抑制LMHFV誘導(dǎo)的ALP活性、OCN表達(dá)增加P0005P0001。ⅢLMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制1LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑初探COX2特異性抑制劑NS398、PKA特異性抑制劑H89、ERK12特異性抑制劑U0126、P38特異性抑制劑SB203580均可抑制LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白的表達(dá)ALLP2CAMPPKA信號(hào)通路對(duì)LMHFV誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響1LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞PKA信號(hào)通路的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15、3HLMHFV組PKA磷酸化活性均較CONTROL組高其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義ALLP2LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響與CONTROL組相比30HZLMHFV加載成骨細(xì)胞后0、05、15H振動(dòng)組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平均較CONTROL組增加P3LMHFV加載成骨細(xì)胞含PGE2條件培養(yǎng)基CONDITIONEDMEDIUMCMPGE2對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響LMHFV加載成骨細(xì)胞后05H形成的CM含PGE2水平最高與CONTROL組相比CMPGE2孵育細(xì)胞05、15、3H后CMPGE2組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平均較CONTROL組高ALLP4腺苷酸環(huán)化酶激活劑FSKOLINFSK對(duì)成骨細(xì)胞內(nèi)CAMP水平的影響與CONTROL組相比15ΜMFSK與成骨細(xì)胞孵育05、15、3H后FSK組細(xì)胞內(nèi)CAMP水平較對(duì)照組明顯升高P0003P5PKA抑制劑對(duì)LMHFV、FSK、CMPGE2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)的影響與CONTROL組相比LMHFVFSK及CMPGE2均能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)P結(jié)論1低強(qiáng)度03G高頻率30HZ振動(dòng)LMHFV對(duì)成骨前體MC3T3E1細(xì)胞生物學(xué)特性具有積極的影響增加MC3T3E1細(xì)胞OPG分泌提高OPGRANKL濃度比；促進(jìn)MC3T3E1細(xì)胞成骨分化。2COX2信號(hào)參與了LMHFV對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。LMHFV誘導(dǎo)MC3T3E1細(xì)胞COX2蛋白表達(dá)可能通過(guò)PKA、ERK12及P38信號(hào)通路；PGE2的自分泌作用在LMHFV通過(guò)PGE2CAMPPKA信號(hào)通路誘導(dǎo)MC3T3E1細(xì)胞COXC2蛋白表達(dá)中起重要作用。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)密級(jí)單位代碼學(xué)號(hào)加夕≥Z1033521017007碩士學(xué)位論文⑧中文論文題目金坐猹盛紅絲塑絲簽處鱉差丞基生塹堂掛陛互窒英文論文題目CULTUREANDBIOLOGICALCHARACTERISTIC臺(tái)B壁壘LY墨I(xiàn)墨Q￡EI墜￡QBL壘繭QE』I塾塾望壘￡IG申請(qǐng)人姓名趕掛指導(dǎo)教師鄞瞳全副教握筮室塑塾援專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)動(dòng)物逮佳直歪生曼繁殖所在學(xué)院動(dòng)塑型堂堂瞳浙江大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得逝婆盤(pán)鱟或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名者拉簽字日期知／≯年石月／汐日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解逝鎏盤(pán)鱟有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)構(gòu)送交本論文的復(fù)印件和磁盤(pán)，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)迸姿盤(pán)鱟可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書(shū)學(xué)位論文作者簽名專(zhuān)鲆導(dǎo)師簽名咆，午簽字日期弘／Y年鄉(xiāng)月／沙日簽字日期矽F埠6月廠(chǎng)己日、們

簡(jiǎn)介：QINGDAOAGRICULTURALUNIVERSITYTHETHESISOFPROFESSIONALMASTERSTUDYOFTHEPARTIALBIONOMICSANDSELECTIONOFDRUGSONEOVISGRADUATEWITHPROFESSIONALMASTERDEGREE‘‘’‘‘WANGL|IUANWANGMENTORPROFESSORKEDONGBISECONDMENTORRESEARCHERXIXIANGLITYPEOFPROFESSIONALDEGREEVETERINARYMEDICINEPROFESSIONALMASTERACADEMICFIELDCLINICALDIAGNOSISOFVETERINARIANDECEMBER,2009QINGDAO．CHINA青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士專(zhuān)業(yè)學(xué)位論文摘要山羊附紅細(xì)胞體部分生物學(xué)特性及藥物篩選試驗(yàn)的研究摘要本試驗(yàn)選擇發(fā)熱、貧血、黃疸癥狀明顯的山羊，通過(guò)鮮血壓片、血液涂片染色鏡檢和電鏡觀(guān)察等方法對(duì)山羊附紅細(xì)胞體形態(tài)學(xué)、運(yùn)動(dòng)學(xué)和染色特性等生物學(xué)特性進(jìn)行研究。結(jié)果表明鮮血壓片后光鏡下觀(guān)察J山羊附紅細(xì)胞體向任意方向作翻轉(zhuǎn)、扭轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)。姬姆薩氏染色和瑞氏染色后光鏡下觀(guān)察，紅細(xì)胞分別被染成藍(lán)色和粉紅色，附著在紅細(xì)胞上的山羊附紅細(xì)胞體都被染成紫紅色，且具有折光性改良瑞氏染色后光鏡下觀(guān)察，紅細(xì)胞被染成深紫色，山羊附紅細(xì)胞體被染成紫紅色吖啶橙染色后熒光顯微鏡下觀(guān)察，紅細(xì)胞為暗綠色，山羊附紅細(xì)胞體為發(fā)明亮熒光的綠色小體。為了篩選出治療山羊附紅細(xì)胞體的有效藥物，本試驗(yàn)在特定的培養(yǎng)條件下進(jìn)行了咪唑笨脲、磷酸伯氨喹、貝尼爾、四環(huán)素、咪唑苯J啄磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾、貝尼爾四環(huán)素等7種用藥方案對(duì)山羊附紅細(xì)胞體的體外藥物殺滅試驗(yàn)，經(jīng)綜合評(píng)價(jià)從中選擇2種體外殺滅效果最好的用藥方案，進(jìn)行山羊附紅細(xì)胞體病治療試驗(yàn)，通過(guò)治療前后臨床常規(guī)檢查、血液涂片鏡檢、血液生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果的綜合比較，確定治療山羊附紅細(xì)胞體痛的首選用藥方案。結(jié)果顯示山羊附紅細(xì)胞體體外藥物殺滅試驗(yàn)中咪唑苯脲磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾體外殺滅效果最好，且在有效濃度范圍內(nèi)對(duì)紅細(xì)胞的影響較輕微；貝尼爾四環(huán)素等效果也較好，但是對(duì)紅細(xì)胞的損傷較重，因此在治療山羊附紅細(xì)胞體病時(shí)首選咪唑苯脲磷酸伯氨喹、咪唑苯脲貝尼爾用藥方案在山羊附紅細(xì)胞體病治療試驗(yàn)申經(jīng)綜合評(píng)價(jià)咪唑苯脲磷酸伯氨喹藥物組對(duì)山羊附紅細(xì)胞體的治療效果略好于咪唑苯脲貝尼爾藥物組，且對(duì)機(jī)體的毒副作用低于咪唑苯脲，可首選咪唑苯脲磷酸伯氨喹聯(lián)合藥物治療山羊附紅細(xì)胞體病。關(guān)鍵詞山羊附紅細(xì)胞體；病原學(xué)；治療；體外殺滅

簡(jiǎn)介：畜禽種質(zhì)資源是維持生態(tài)安全、農(nóng)業(yè)穩(wěn)定的重要資源，它推動(dòng)著經(jīng)濟(jì)的繁榮與社會(huì)的進(jìn)步。重要的家養(yǎng)動(dòng)物種質(zhì)資源應(yīng)該受到重視，并得到有效的保護(hù)。間充質(zhì)干細(xì)胞可以在體外快速增殖并且可以向其他細(xì)胞分化。這些優(yōu)點(diǎn)使得它們成為畜禽種質(zhì)資源保存研究的新渠道。本實(shí)驗(yàn)以肉雞真皮來(lái)源和鵝心臟來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了分離培養(yǎng)、生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究，并得到以下結(jié)果1利用膠原酶Ⅰ和胰蛋白酶分離得到肉雞真皮間充質(zhì)干細(xì)胞DERMALMESENCHYMALSTEMCELLS，DMSCS并在體外條件下培養(yǎng)31代，細(xì)胞形態(tài)主要為長(zhǎng)梭形。RTPCR鑒定結(jié)果顯示，細(xì)胞表達(dá)CD73、CD29、CD44，和CD71基因。免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示肉雞DMSCS陽(yáng)性表達(dá)CD105、CD90、CD73和CD44表面標(biāo)記物。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，CD29、CD44和CD73在肉雞DMSCS中高表達(dá)。DMSCS的生長(zhǎng)曲線(xiàn)為明顯的“S”形，與細(xì)胞在體外增殖的通常規(guī)律基本吻合。DMSCS的群體倍增時(shí)間和克隆形成能力的結(jié)果表明細(xì)胞的增殖能力隨著代次的升高而減弱。研究表明肉雞DMSCS能夠在一定的條件下被分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞，通過(guò)特異性染色和RTPCR鑒定證明肉雞DMSCS向這三種細(xì)胞成功分化。2利用膠原酶Ⅱ和胰蛋白酶分離得到鵝心臟間充質(zhì)干細(xì)胞HEARTDERIVEDMESENCHYMALSTEMCELLS，HMSCS，并在體外培養(yǎng)21代，細(xì)胞形態(tài)特征呈現(xiàn)梭狀。RTPCR和免疫組化檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果都顯示細(xì)胞表達(dá)CD29，CD34，CD73，CD166和CD44等MSCS特異基因。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析，CD29，CD34，CD73，CD166和CD44在鵝HMSCS中高表達(dá)。HMSCS的生長(zhǎng)曲線(xiàn)表明HMSCS經(jīng)過(guò)短暫潛伏期，進(jìn)入迅速增殖的對(duì)數(shù)期，而后進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期，呈現(xiàn)出明顯的“S”形，與細(xì)胞體外生長(zhǎng)的基本規(guī)律吻合。群體倍增時(shí)間結(jié)果表明HMSCS的增殖能力隨著代次的升高逐漸減弱。通過(guò)在培養(yǎng)基中加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)因子對(duì)HMSCS進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)，通過(guò)特異性染色和RTPCR等方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HMSCS成功被分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，說(shuō)明鵝HMSCS可以向多個(gè)方向誘導(dǎo)。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功分離培養(yǎng)了肉雞DMSCS和鵝HMSCS，并且對(duì)它們進(jìn)行了生物學(xué)特性研究和誘導(dǎo)分化研究。結(jié)果顯示，肉雞DMSCS和鵝HMSCS均表現(xiàn)出MSCS特有的生物學(xué)特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)畜禽種質(zhì)資源保存具有重要的意義，并且為再生醫(yī)學(xué)和組織工程學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

簡(jiǎn)介：分類(lèi)號(hào)密級(jí)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文感染豬鏈球菌2型后細(xì)胞因子的變化以及分泌核酸酶A的生物學(xué)研究CHANGESOFCYTOKINESEXPRESSIONPROGILEINPIGSINFEETEDBYSTREPTOEOCCUSSUISTYPE2ANDBIOLOGIEPROERTYSTUDYOFSEERETEDNUCIEASEA研究生康超指導(dǎo)教師金梅林教授指導(dǎo)小組陳煥春教授金梅林教授郭愛(ài)珍教授周銳教授貝為成副教授專(zhuān)業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)獲得學(xué)位名稱(chēng)農(nóng)學(xué)碩士研究方向動(dòng)物傳染病獲得學(xué)位時(shí)間2008年6月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院二00八年六月華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2008屆碩士學(xué)位論文226引物設(shè)計(jì)，合成和融解曲線(xiàn)的檢測(cè)23227。DNAPCR擴(kuò)增鑒定和RNA樣品中DNA檢鋇L24228熒光定量反應(yīng)24229數(shù)據(jù)處理243結(jié)果2531豬的臨床癥狀2532CDNAPCR擴(kuò)增鑒定和RNA樣品中DNA檢測(cè)2533熒光定量PCR的融解曲線(xiàn)，2634熒光定量PCR擴(kuò)增細(xì)胞因子結(jié)果274討論2941DNA的定量的研究，2942各個(gè)細(xì)胞因子MRNA的表達(dá)305小結(jié)31第三章分泌核酸酶SSNA的生物學(xué)特性研究咒1前言322材料和方法3221材料，32211菌株及質(zhì)粒，犯212酶及主要試劑，32213一抗和二抗33214免疫動(dòng)物34215主要試劑及溶液的配制34216細(xì)菌培養(yǎng)基34217質(zhì)粒抽提相關(guān)溶液34218SDS一PAGE相關(guān)溶液35219WESTEM一BLOT及蛋白質(zhì)斑點(diǎn)雜交緩沖液3521IOELISA相關(guān)溶液362111其他3622方法37221弓1物設(shè)計(jì)37222基因組DNA的提取37223分泌核酸酶SSNA基因的克隆37224PCR產(chǎn)物的回收與純化，38225PCR產(chǎn)物與PET28A載體的連接38226感受態(tài)細(xì)胞的制備氯化鈣法38227連接產(chǎn)物及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化39228質(zhì)粒的小量制備堿裂解法39229重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定392210大腸桿菌BLZIDE3的誘導(dǎo)表達(dá)392211確定最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件、402212小量誘導(dǎo)402213大量誘導(dǎo)402214多克隆抗體的制備4022141免疫原的制備40