催化抗體制備及其用于選擇性水解和不對稱還原反應(yīng)的研究.pdf

1、催化抗體，也稱抗體酶，是一類具有催化活性的免疫球蛋白。它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性。催化抗體的研究和開發(fā)預(yù)示著生物催化劑可以通過人工設(shè)計與制備，由此開辟了一個嶄新的模擬酶的研究方向，也成為生物催化和生物催化劑的一個新的研究領(lǐng)域，無論是在理論探索還是實踐應(yīng)用方面都具有極其廣闊的前景，尤其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、制藥學(xué)等學(xué)科中將產(chǎn)生重要的影響。催化抗體是多學(xué)科研究的交匯點，涉及了化學(xué)、生物學(xué)、生物技術(shù)、有機(jī)生物和藥物研究等領(lǐng)域。催化抗體的

2、優(yōu)化設(shè)計和制備以及催化抗體的酶學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)規(guī)律等是在發(fā)展催化抗體技術(shù)中的幾個關(guān)鍵問題，需要深入探究。本文的主要目的就是要運(yùn)用分子設(shè)計和制備手段來制得特定的催化抗體，為制備手性藥物和手性藥物中間體服務(wù)，重點考慮在非水介質(zhì)中的應(yīng)用研究。本文完成的主要工作如下：
　　 催化布洛芬甲酯選擇性水解的催化抗體設(shè)計和制備。通過對布洛芬甲酯水解的機(jī)理分析，根據(jù)過渡態(tài)理論設(shè)計和合成了四面體含磷和含硫半抗原作為半抗原，并與牛血清蛋白(BSA)偶聯(lián)制

3、備成免疫源，經(jīng)免疫和克隆成功篩選出具有催化加速選擇性水解生成S-布洛芬的特異性催化抗體，其Kcat/Kuncat達(dá)到了1.6×104。通過對所篩選的催化抗體的酶學(xué)性質(zhì)和反應(yīng)性的考察，得到了催化抗體的最適pH和溫度范圍，分別為7.0～8.0和30～40℃。在對其熱穩(wěn)定性的考察中發(fā)現(xiàn)，催化抗體對熱很敏感，超過55℃其催化活性基本消失。通過對催化抗體催化布洛芬甲酯的選擇性反應(yīng)動力學(xué)分析，建立了動力學(xué)方程。結(jié)果顯示，盡管催化抗體與酶在形成的中間

4、態(tài)不一樣，但催化反應(yīng)同樣符合Michaelis—Menten的動力學(xué)規(guī)律，并擬合得到了動力學(xué)參數(shù)Km為28.31μmol·l-1，Kcat為1.01 s-1。
　　 W/O型微乳液體系中催化抗體催化布洛芬甲酯選擇性水解：探索了催化抗體在W/O型微乳液體系中的酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果表明，催化抗體在W/O型微乳中保持著催化能力。影響催化抗體催化的反應(yīng)初速度的最佳w0(體系中水和琥珀酸二辛酯磺酸鈉(AOT)的摩爾比)為21，較適合的pH和溫度

5、為8.0和30～40℃。在分析了水不溶性的底物在微乳膠束體系內(nèi)的物質(zhì)分配和表面活性劑影響的基礎(chǔ)上，對催化抗體作為催化劑在W/O型微乳液介質(zhì)中的反應(yīng)的動力學(xué)進(jìn)行了探索研究，從理論上得到了在膠束體系中Vmax和Kappcat不變，而KappM=KM(1+Kab[Ms])較水相反應(yīng)的Km有所增加。實驗結(jié)果較好地驗證了這個結(jié)論。在本研究的微乳體系中，表面活性劑對催化抗體的活性抑制為競爭性抑制，其Ki為1.5×10-3mol·l-1。
　　

6、 共溶劑體系中催化抗體的催化消旋布洛芬甲酯的選擇性水解反應(yīng)：首次把由催化抗體催化消旋布洛芬甲酯的選擇性水解反應(yīng)用到共溶劑體系中。基于產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率和對映選擇性，考察了9種與水共溶的溶劑，建立了以N，N-二甲基甲酰胺為添加的共溶劑，加量為6％(v/v)和緩沖液組成的共溶劑體系。利用建立的共溶劑體系中溶劑疏水作用和底物及產(chǎn)物的良好分散作用，促進(jìn)了反應(yīng)的進(jìn)程，在保持良好的對映選擇性(ee>99％)基礎(chǔ)上，有效地提高了轉(zhuǎn)化率，使之達(dá)到了41.7

7、％。通過考察催化抗體在共溶劑體系中動力學(xué)參數(shù)，說明了單相共溶劑體系對催化抗體的催化轉(zhuǎn)化率的提高有著積極的作用。
　　 脂包衣的催化抗體在單相共溶劑體系中催化布洛芬甲酯的選擇性水解：以催化活性為指標(biāo)，得到了N，N-二甲基甲酰胺20％(v/v)和磷酸緩沖溶液組成的單相共溶劑反應(yīng)體系?？疾炝擞弥麓呋贵w和脂包衣脂肪酶催化選擇性水解布洛芬甲酯的實驗。得到了最佳反應(yīng)溫度和pH值的范圍分別是脂包衣催化抗體反應(yīng)條件35～40℃和7.5～8

8、.5，脂包衣脂肪酶的最適反應(yīng)條件為：pH值為7.5，溫度為40℃。在最適的反應(yīng)條件下，用脂包衣的脂肪酶催化選擇性水解拆分得到了S-布洛芬的最大轉(zhuǎn)化率可達(dá)46.3％，對映選擇率達(dá)241。脂包衣催化抗體的最大轉(zhuǎn)化率可達(dá)44.5％，對映選擇率>500。同時考察了脂包衣催化抗體和脂包衣脂肪酶的催化選擇性水解的動力學(xué)，結(jié)果符合米氏動力學(xué)方程。其中Vmax為0.56mmol·min-1·g-1，Kcat為5.7min-1，比在水相和6％DMF加量的

9、單相共溶劑體系催化水平明顯有所提高。在脂包衣脂肪酶(250 mg/ml)，DMF20％(v/v)，40℃，pH=7.5條件下，脂包衣脂肪酶催化布洛芬甲酯的選擇性水解符合米氏方程。結(jié)果表明，脂包衣脂肪酶的Km只有沒有包衣的天然酶的Km的一半，Vmax是未包衣的酶的1.4倍左右。脂包衣催化抗體在單相共溶劑體系中和在緩沖液中的失活動力學(xué)符合一級失活動力學(xué)模型，其失活反應(yīng)方程為：KD=7.87×107 exp(-50.6/RT)，在緩沖液中的失

10、活反應(yīng)方程為：KD=3.41×1012 exp(-64.6/RT)。
　　 催化抗體催化3-氯苯丙酮還原制備3-氯-苯丙醇：在分析了3-氯-苯丙酮不對稱還原反應(yīng)機(jī)理的基礎(chǔ)上，根據(jù)半抗原設(shè)計的誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)換設(shè)計的原理，設(shè)計和合成了N-氧化物作為反應(yīng)過渡態(tài)類似物作為半抗原，免疫并克隆化后篩選分離得到了一株能立體選擇性催化3-氯-苯丙酮還原生成(S)-3-氯-苯丙醇的單克隆抗體。催化反應(yīng)得到的ee值和轉(zhuǎn)化率分別為96.2％和83.2％。通

11、過對催化抗體催化3-氯-苯丙酮的不對稱還原動力學(xué)過程的研究，得到其過程符合有序序列BiBi機(jī)制，經(jīng)多步回歸和計算得到了其速度方程：v=1.13×10-5[3-chloropropiophenone][NaBH4]/5.46×10-9+4.55×10-4[3-chloropropiophenone]+[3-chloropropiophenone][NaBH4]動力學(xué)方程與實驗值較為符合。
　　 總之，本文圍繞著催化選擇性水解和不對