綠針假單胞菌GP72中2-羥基-吩嗪的合成機(jī)理及其雙組分調(diào)控系統(tǒng)RpeA-RpeB的研究.pdf

1、2-羥基吩嗪（2-hydroxyphenazine，2-OH-PHZ）對(duì)許多真菌及細(xì)菌均具有較強(qiáng)的拮抗作用，是一種潛在的生物農(nóng)藥。針對(duì)某些病原菌，2-OH-PHZ的拮抗作用強(qiáng)于吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxilic acid，PCA）。然而，無論是通過化學(xué)合成還是生物合成的方法，其產(chǎn)量都非常低。本課題通過研究2-OH-PHZ的合成機(jī)理及雙組分調(diào)控系統(tǒng)RpeA/RpeB對(duì)其的調(diào)控機(jī)制，為提高其產(chǎn)量及大規(guī)模應(yīng)用奠定了理

2、論基礎(chǔ)。
　　目前2-OH-PHZ的合成路徑基本明確：以PCA為前體，在單加氧酶PhzO的作用下生成2-羥基吩嗪-1-羧酸（2-hydroxyphenazine-1-carboxilic acid,以下簡(jiǎn)稱2-OH-PCA），2-OH-PCA脫羧形成關(guān)于2-OH-PHZ。但是關(guān)于其合成機(jī)理尚且存在爭(zhēng)議，其中一個(gè)爭(zhēng)論點(diǎn)在于PhzO是否是催化這一反應(yīng)的唯一必需酶。本課題通過異源表達(dá) PhzO蛋白，并研究了不同條件對(duì)其生物活性的影響。結(jié)

3、果證明28℃，pH=7.0條件下，PhzO生物活性最強(qiáng)。外源添加1mM的Fe3+能促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng) PCA濃度>120mg/L時(shí)，2-OH-PHZ的產(chǎn)量反而降低。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了PhzO蛋白的表達(dá)條件，通過分子篩純化獲得 PhzO蛋白酶，并研究其在不同條件下的酶活性。結(jié)果證明在 Fe3+和 NADP(H)的共同作用下，PhzO能成功修飾PCA生成衍生物。
　　另一個(gè)關(guān)于合成機(jī)理的爭(zhēng)論點(diǎn)則在于2-OH-PCA脫羧是否能夠自發(fā)進(jìn)行。

4、本課題從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保藏的2-OH-PCA高產(chǎn)菌株綠針假單胞菌 GP72AN（Pseudomonas chlororaphis GP72AN）出發(fā)，發(fā)酵制備2-OH-PCA，得到純度為99.4%的2-OH-PCA樣品。檢測(cè)其在不同溫度及pH條件下的脫羧反應(yīng)，并對(duì)這一化學(xué)反應(yīng)過程作了定量數(shù)學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這一轉(zhuǎn)化過程是自發(fā)且對(duì)溫度、pH敏感，符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。
　　本課題進(jìn)一步探討RpeA/RpeB對(duì)綠針假單胞菌GP72中P

5、CA及其衍生物的生產(chǎn)的影響。RpeA/RpeB是GP72雙組分調(diào)控系統(tǒng)中的一組。RpeA已被證實(shí)對(duì)GP72吩嗪合成起負(fù)調(diào)控作用。本課題通過PCR成功克隆鑒定了rpeA相對(duì)應(yīng)的應(yīng)答調(diào)控基因rpeB，并通過同源重組技術(shù)分別在野生型及GP72AN的基礎(chǔ)上構(gòu)建了rpeB基因突變株GP72BN和GP72ANBN。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在KB培養(yǎng)基中雙組分調(diào)控系統(tǒng)RpeA、RpeB對(duì)吩嗪合成調(diào)控作用不同，rpeB突變株的PCA和2-OH-PHZ的產(chǎn)量均下

6、降，而rpeA突變株的PCA和2-OH-PHZ的產(chǎn)量均上升。而在GP72BN中通過回補(bǔ)rpeB基因可以恢復(fù)其吩嗪合成能力。通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相對(duì)于野生型，在GP72BN中，phzI/phzR和phzE轉(zhuǎn)錄水平均顯著下調(diào)，而在GP72AN中相對(duì)于GP72BN phzI/phzR和phzE轉(zhuǎn)錄水平則顯著上調(diào)。在GP72BN和GP72AN中phzO基因的轉(zhuǎn)錄水平變化均不顯著。在野生型中，rpeA和rpeB在不同培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)

7、錄水平差異顯著。由此推測(cè)RpeA/RpeB對(duì)PCA合成的調(diào)控很有可能是通過對(duì)phzI/phzR和吩嗪合成基因簇的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)的，進(jìn)而調(diào)控其衍生物的合成，且 rpeA/rpeB可能是環(huán)境依賴型雙組分調(diào)控系統(tǒng)。進(jìn)一步對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)RpeA/RpeB對(duì)GP72吩嗪合成調(diào)控作用進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在低磷培養(yǎng)基中，RpeA、RpeB對(duì)吩嗪合成都起正向調(diào)控作用。
　　在假單胞菌中，存在于RpeA/RpeB上游的rndA/rndB主動(dòng)外排系統(tǒng)基因