細(xì)胞色素b-,5-向細(xì)胞色素c的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化以及不同表達(dá)體系對(duì)其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能的影響.pdf

1、血紅素蛋白是一大類(lèi)含有原卟啉Ⅸ(血紅素，heme)作為輔基的金屬蛋白，在生命體系中執(zhí)行著重要的生物功能，如氧載體功能(血紅蛋白，Hb和肌紅蛋白，Mb)，電子傳遞功能(細(xì)胞色素b5，cytb5和細(xì)胞色素c，cytc等)，生物催化功能(細(xì)胞色素P450，cytP450和細(xì)胞色素c過(guò)氧化物酶，CcP等)，以及生物傳感功能(CO傳感器CooA和NO傳感器sGC等)。相同的輔基heme如何被不同的蛋白分子所利用，來(lái)執(zhí)行不同的生物功能，一直是化學(xué)生

2、物學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)研究領(lǐng)域所關(guān)注的重點(diǎn)，人們正試圖對(duì)這一問(wèn)題進(jìn)行解答來(lái)認(rèn)識(shí)金屬蛋白結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-反應(yīng)-功能之間所蘊(yùn)含的精妙關(guān)系。 Cytb5是血紅素蛋白中電子傳遞蛋白的典型代表，其輔基heme與蛋白肽鏈的結(jié)合是以非共價(jià)鍵的方式進(jìn)行的，結(jié)合能力主要來(lái)自heme軸向雙組氨酸His39和His63的配位作用，以及氫鍵和疏水作用等。Cytb5與cytc不同，后者輔基heme的兩個(gè)乙烯基與蛋白肽鏈上結(jié)合heme的結(jié)構(gòu)片段域Cys-Xaa-Xa

3、a-Cys-His(CXXCH)中的半胱氨酸形成了兩個(gè)硫醚鍵，因而以共價(jià)鍵的方式相互結(jié)合。同時(shí)，與cytc或Mb相比，cytb5分子中輔基heme有著更大的溶液暴露程度。這些原因直接導(dǎo)致了cytb5具有較低的輔基結(jié)合穩(wěn)定性。 縱觀cytb5的研究歷程，我們發(fā)現(xiàn)關(guān)于cytb5軸向配體的研究相對(duì)較少，這主要是因?yàn)閔eme軸向配體的突變會(huì)很大程度上降低cytb5的輔基結(jié)合能力，以至于通過(guò)體內(nèi)表達(dá)的方法得不到軸向突變體的全蛋白(holo

4、-protein)，只能表達(dá)出沒(méi)有結(jié)合heme的脫輔基蛋白(apo-protein)。后者由于蛋白穩(wěn)定性低，而且沒(méi)有holo-protein的特征紅色，給后續(xù)分離純化帶來(lái)了很大的困難，操作過(guò)程較提純cytb5復(fù)雜得多，往往需要投入很多時(shí)間和精力，才能獲得足夠純度的蛋白用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。 然而，關(guān)于血紅素蛋白結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能的很多研究，正是集中在活性中心輔基heme的軸向配體上。因此，如何提高cytb5輔基結(jié)合的穩(wěn)定性，以及如何

5、簡(jiǎn)化cytb5的分離純化方法，特別是如何使用簡(jiǎn)便的提純方法來(lái)獲得cytb5軸向突變體的apo-protein，是一系列值得研究與探索的課題。 由于cytb5中并不存在cytc中所具有的結(jié)合heme的結(jié)構(gòu)片段域CXXCH，而且整個(gè)蛋白肽鏈中并不存在Cys，因此無(wú)法形成類(lèi)似cytc中的硫醚鍵。通過(guò)對(duì)cytb5晶體結(jié)構(gòu)信息作仔細(xì)深入地研究后，我們發(fā)現(xiàn)距離heme2-乙烯基和4-乙烯基最近的氨基酸殘基分別為Ser71和Asn57，它們的

6、β位碳原子與2-、4-乙烯基α碳原子的距離分別為4．32和3．86(A)。這樣的距離很適合共價(jià)鍵的形成，如果將這兩個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基分別用Cys取代，在蛋白表達(dá)的過(guò)程中，所引入的Cys極有可能分別與heme的兩個(gè)乙烯基發(fā)生加成反應(yīng)，形成類(lèi)似cytc中的硫醚鍵。因此，我們運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法構(gòu)建了cytb5N57C、cytb5S71C以及cytb5N57C／S71C突變體，并對(duì)其進(jìn)行了性質(zhì)表征。 研究證明，在cytb5分子中heme

7、乙烯基附近適當(dāng)?shù)奈恢靡氚腚装彼?，通過(guò)體內(nèi)表達(dá)的方法，的確可以實(shí)現(xiàn)輔基heme與蛋白肽鏈的共價(jià)鍵合。所引入的Cys與heme分別形成了兩種不同的Cysteine-Heme共價(jià)鍵：其中在57位形成了經(jīng)典的硫醚鍵，而在71位形成了非典型的[heme-CO-CH2-S—CH2-Ca]鍵。這種差別主要取決于所引入半胱氨酸與heme乙烯基之間的距離，乙烯基自身的取向，以及各自所處的微環(huán)境等因素。研究結(jié)果也表明并不需要構(gòu)建類(lèi)似cytc中所特有的結(jié)合

8、heme的結(jié)構(gòu)片段域CXXCH，即可實(shí)現(xiàn)cytb5向cytc的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，這說(shuō)明CXXCH對(duì)于heme與蛋白肽鏈間的共價(jià)鍵合并非是必需的因素。而且，我們研究發(fā)現(xiàn)，具有heme共價(jià)鍵合的cytb5(cytc-likecytb5)在去折疊狀態(tài)下表現(xiàn)出相當(dāng)高的過(guò)氧化酶催化活性。這些研究成果為我們認(rèn)識(shí)c-型細(xì)胞色素的形成機(jī)理，以及認(rèn)識(shí)血紅素蛋白的結(jié)構(gòu)-性質(zhì)-反應(yīng)-功能之間的關(guān)系，提供了重要的信息。 在尋求分離純化cytb5的簡(jiǎn)化方法過(guò)程中

9、，我們嘗試了用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶表達(dá)系統(tǒng)，將cytb5表達(dá)為GST-cytb5融合蛋白的方式進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，cytb5的確可以以融合蛋白的形式進(jìn)行表達(dá)，而且可以在體內(nèi)表達(dá)得到結(jié)合有輔基heme的holo-protein。GST-cytb5融合蛋白的表達(dá)體系具有其他cytb5表達(dá)體系無(wú)法比擬的優(yōu)越性，其操作相對(duì)簡(jiǎn)單，只需經(jīng)過(guò)一步GST親和層析即可得到目標(biāo)融合蛋白。同時(shí)，融合蛋白的性質(zhì)表征表明：融合蛋白內(nèi)GST與cytb5之間的

10、蛋白一蛋白相互作用相對(duì)較弱，它們的相互融合并沒(méi)有很大程度上改變彼此的整體結(jié)構(gòu)與基本功能。一方面GST-cytb5融合蛋白有著與cytb5相類(lèi)似的性質(zhì)與功能，另一方面它又具有GST的親和性，這使得融合蛋白具有雙重功能與應(yīng)用前景。然而，在表達(dá)GST-cytb5軸向突變體蛋白時(shí)，只能得到apo-protein，而且，GST對(duì)heme的高親和性嚴(yán)重影響了GST-cytb5突變體蛋白apo-protein與heme的體外重組。因而，GST表達(dá)體系

11、并不適合用來(lái)獲得涉及cytb5軸向突變的突變體蛋白holo-protein。 此外，我們還通過(guò)組氨酸標(biāo)記表達(dá)體系，在cytb5分子的N．端引入(His)6-tag，然后用Ni2+親和柱對(duì)cytb5進(jìn)行分離純化。研究表明，(His)6-cytb5有著與cytb5相類(lèi)似的光譜學(xué)、電化學(xué)以及化學(xué)穩(wěn)定性，說(shuō)明(His)6-tag的引入對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能沒(méi)有明顯地影響。同時(shí)，(His)6-tag的引入不影響apo-protein與h

12、eme的體外重組。因此，這種方法更適用于cytb5軸向突變的突變體蛋白holo-protein的獲得。通過(guò)這種方法，我們獲得了(His)6-cytb5H39G單點(diǎn)突變體，以及軸向His39與Gly42進(jìn)行序列上互換的雙點(diǎn)突變體蛋白[(His)6-cytb5H39G／G42H]。對(duì)突變體蛋白表征的結(jié)果表明：當(dāng)heme軸向配位的組氨酸由39位轉(zhuǎn)移至42位，仍能形成heme的軸向配體，只是相對(duì)天然的His39來(lái)說(shuō)，His42的配位能力較弱。這