細(xì)胞色素b,5his39和表面酸性殘基對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能的影響

1、復(fù)旦大學(xué)博士學(xué)位論文細(xì)胞色素bHis39和表面酸性殘基對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能的影響姓名：王文虎申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：無機化學(xué)指導(dǎo)教師：黃仲賢2001.11.8置換。為了克服突變體蛋白穩(wěn)定性降低引起的蛋白表達(dá)的困難，我們建立了新的蛋白表達(dá)體系( p U C l 9 ／J M 8 3 一p E T l l c ／B L 2 1 ( D E 3 ) p l y s S ) ，小試結(jié)果表明盡管幾乎所有的突變體基因都得到高效表達(dá)，但是沒有發(fā)現(xiàn)

2、能夠在發(fā)酵過程中在宿主菌體內(nèi)結(jié)合血紅素的突變體全蛋白。這說明細(xì)胞色素6 ，軸向配位突變使得蛋白穩(wěn)定性大幅度降低的困難在我們的體系中也未能避免。我們從構(gòu)建的細(xì)胞色素b ，H i s 3 9 位軸向突變體基因庫中選擇了編碼H i s 3 9 C y s ，H i s 3 9 S e r 和H i s 3 9 G l n 三種含有親水性氨基酸殘基置換的突變體蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)，通過純化得到的脫輔基蛋白可以與血紅索在體外重組為突變體全蛋

3、白。這些置換殘基的體積大都小于野生型蛋白中的組氨酸，將可能形成底物結(jié)合空穴，殘基的親水性也將提高蛋白質(zhì)疏水內(nèi)核對極性底物的親和性，這些都將有利于突變體蛋白質(zhì)實現(xiàn)催化反應(yīng)功能。選擇它們的原因還在于這三種突變體的3 9 位殘基分別具有以S ( C y s ) 、O ( S e r ) 或N ( G i n ) 原子與血紅素鐵離子配位的潛在可能性，這種可能的配位將起到穩(wěn)定全蛋白質(zhì)的作用，當(dāng)然外源配體或反應(yīng)底物也可以使其被競爭而脫離。我們在細(xì)胞

4、色素b ，分子疏水內(nèi)核的關(guān)鍵軸向配體位置引入了非保守的親水性氨基酸殘基置換，這在該蛋白質(zhì)分子軸向突變研究工作中尚屬首次。突變體蛋白質(zhì)的電噴霧質(zhì)譜結(jié)果表明實驗測得的突變體蛋白質(zhì)的分子量與理論計算分子量相當(dāng)吻合，從而證實了我們成功地實現(xiàn)了基因突變并獲得了高純度的目標(biāo)突變體蛋白質(zhì)。熱變性實驗的結(jié)果證明了所有突變體蛋白的血紅素輔基結(jié)合穩(wěn)定性相對于野生型均大為降低。外源配體一瞇唑可以起到穩(wěn)定H i s 3 9 S e r 和H i s 3 9 G

5、 l n 的作用，而在沒有外源配體的情況下，這兩種突變體的全蛋白均不能在室溫下穩(wěn)定存在。從光譜電化學(xué)實驗得到的突變體蛋白氧化還原電位較之野生型蛋白質(zhì)都有大幅度的負(fù)移，這也預(yù)示了突變體的功能變化。三種突變體蛋白質(zhì)的電子吸收光譜與野生型蛋白的光譜結(jié)果相比都有很明顯的改變，這些性質(zhì)的變化反映了蛋白質(zhì)軸向配位環(huán)境的變動：氧化態(tài)的H i s 3 9 S e r和H i s 3 9 G l n 突變體蛋白質(zhì)擁有H i s 6 3 - - h e m

6、 e ．F e ( I I I 卜_ H 2 0 形式的六配位環(huán)境，血紅素鐵離子處于高自旋狀態(tài)，而還原態(tài)蛋白質(zhì)血紅素亞鐵離子主要處于H i s 6 3 - - 1 a e m e —F e ( n ) - - - S e r 3 9 ( o r G l n 3 9 ) 六配位環(huán)境和低自旋狀態(tài)：氧化態(tài)的H i s 3 9 C y s 突變體蛋白質(zhì)則擁有H i s 6 3 - - h e m e —F e ( I I I 卜_ c y s