β-果糖基轉移酶和β-呋喃果糖苷酶的分離純化及其在FOS生產(chǎn)中的應用.pdf

1、低聚果糖(FOS)因其具有高效增殖雙歧桿菌、排毒潔腸、低卡值防齲齒和改善脂質代謝(降血脂及膽固醇)等優(yōu)異性能，逐漸受到消費者的青睞。β-果糖基轉移酶(FTS)和β-呋喃果糖苷酶(FFS)分別起到催化蔗糖生產(chǎn)FOS和水解蔗糖、FOS的作用。作者以米曲霉GX1100產(chǎn)FTS和FFS為研究對象，做了如下工作： 1．在500ml搖瓶， 200ml裝液量條件下，綜合考慮了不同種類和濃度的碳源、氮源、微量元素以及溫度、pH值、搖床轉速等對產(chǎn)

2、酶的影響，通過正交設計與單因素實驗結合的方法，得出產(chǎn)FTS優(yōu)良菌株米曲霉GX0011的最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖24g/L，酵母0.5％(w/v)，K<,2>SO<,4>0.1％，接種量3％，培養(yǎng)溫度29℃，培養(yǎng)時間32h，搖床轉速170rpm，PH6.5。FTS的平均最大產(chǎn)酶為16.928U/ml培養(yǎng)基，是優(yōu)化前的5倍。 2．依次通過熱變性、硫酸銨分級沉淀以及DEAE-Sephadex A-50(1)、Octyl-Sepharose

3、 C1-4B、Sephacwl S-300、DEAE-Sephadex A-50(2)等柱層析步驟，得到了電泳純的FTS和FFS，F(xiàn)TS的純化倍數(shù)、比活和回收率分別為121.7倍，1975U/mg和17％，F(xiàn)FS則相應為396.4倍， 983 U/mg和7％。從SDS-PAGE電泳檢測結果計算得到FTS的亞基表觀分子量為51kDa，F(xiàn)FS的亞基表觀分子量為31 kDa。不擴散的清晰條帶以及較小的分子量，說明該FTS只是普通的蛋白質酶類，

4、不是糖蛋白。酶活測定表明轉果糖基作用和水解糖苷鍵作用分屬FTS、FFS兩個酶完成。 3.FTS的最適反應溫度和pH值分別為40℃、5.5；而FFS對應為pH4．0、55℃。在pH5.5～7.5和小于45℃時，F(xiàn)TS較穩(wěn)定；FFS在pH3.0～5.0和小于60℃時，活力保持較好。對FTS的動力學研究可知，K<,m>和V<,max>分別為240.530g/L、2.217g/L/min。葡萄糖是該FTS的競爭性抑制劑，K；173.47

5、2g/L。FFS的V<,max>和K<,m>分別為0.2585 g/L/min和10.5719g/L，果糖是該FFS的競爭性抑制劑，K<,i> 3.664g/L。FTS在10％和50％蔗糖濃度時的最大FOS產(chǎn)率分別為57.47％、62.85％。另外，作者還研究了常見堿金屬，堿土金屬，過渡金屬離子以及絡合劑，變性劑對FTS和FFS的影響，未發(fā)現(xiàn)明顯的激活劑。 4．根據(jù)FTS活性基團化學修飾的結果，在有無底物保護條件下，苯甲磺酸氟(

6、PMSF)、N-溴代二酰亞胺(NBS)、 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)均能顯著抑制FTS的活力，并且活力的下降與修飾劑的濃度基本呈線性關系，而2，4，6-三硝基苯磺酸鈉(TNBS)對該酶活力的抑制在有無底物保護情況下結果相同。因此，推測FTS活性中心可能包括絲氨酸殘基，色氨酸殘基，天冬氨酸(谷氨酸)殘基，而賴氨酸殘基對酶活有一定影響，可能與維系酶活性中心構象有關。它們的IC<,50>分別為27.08 mmo

7、l/L、5.50 mmol/L、25.86 mmol/L和18.59mmol/L。 5．實驗結果表明，乙醇和復合抑制劑A、B在基本保持或提高FTS活力條件下，抑制FFS活力效果顯著。研究發(fā)現(xiàn)，在特定頻率下，分別用(A+300)W、20min或(A+700)W、5min超聲波處理粗酶液時，均使FTS活力保持97％左右的同時，使FFs活力損失約57％。在10％、50％蔗糖底物時，F(xiàn)OS最大含量分別達55.72％和62.15％，結果和