短梗霉P6菌株中有菊粉酶活性的β-呋喃果糖苷酶的研究.pdf

1、β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase，EC3.2.1.26)，是糖苷水解酶GH32家族的成員。它不但可以催化蔗糖水解為果糖和葡萄糖，而且具有一定果糖轉(zhuǎn)移酶活性，參與以蔗糖為底物合成寡糖。廣泛存在于細(xì)菌、酵母、絲狀真菌、高等植物和許多動(dòng)物細(xì)胞中。
　　短梗霉(A ureobasidium sp.)P6菌株（以下簡(jiǎn)稱P6菌株）是從海洋環(huán)境中分離獲得的，可以產(chǎn)生多聚蘋果酸的菌株，同時(shí)該菌株具有一定分解菊粉能力。在之

2、前的研究中，并沒有短梗霉(Aureobasidium spp.)具有菊粉酶基因的相關(guān)報(bào)道，但短梗霉可產(chǎn)β-呋喃果糖苷酶的研究較多，本研究旨在探究P6菌株分解菊粉的能力與β-呋喃果糖苷酶活力的關(guān)系，以便獲得高產(chǎn)具有菊粉酶活力的β-呋喃果糖苷酶生產(chǎn)菌株。
　　本研究首先在實(shí)驗(yàn)室短梗霉菌種庫中分離篩選到了具有較強(qiáng)分解菊粉能力的P6菌株，其初始菊粉酶活力為16.5±0.6 U/mL;經(jīng)過產(chǎn)酶條件優(yōu)化，確定P6菌株分解菊粉的最佳培養(yǎng)基組成為

3、:菊粉2.5％(w/v)，酵母粉1.0％(w/v)，接種量2.5％(v/v)，硫酸銨0.6％(w/v)，磷酸二氫鉀1.0％(w/v)，七水硫酸亞鐵0.05％(w/v)，七水硫酸鎂0.1％(w/v);在此條件下，經(jīng)28℃和180 rpm振蕩培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)發(fā)酵液菊粉酶活力單位達(dá)到26.15±0.5 U/mL;并進(jìn)行了10-L發(fā)酵罐（裝液量6.0L）擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵108 h后發(fā)酵液菊粉酶活力單位最高達(dá)到30.98±0.8 U/mL

4、，發(fā)酵144 h總糖幾乎完全利用，總糖利用率達(dá)到98％以上。
　　在P6菌株的最佳產(chǎn)酶條件下，經(jīng)高壓破碎、離心濃縮、DEAE Sepharose離子交換柱、Sephadex S-100凝膠過濾層析等步驟分離與純化得到了具有菊粉酶活力的β-呋喃果糖苷酶，其表觀分子量約為47.6 kDa;所得β-呋喃果糖苷酶水解菊粉最適溫度60℃，55℃以下熱穩(wěn)定性良好，最適pH為4.5，在pH3.0-8.0之間，酶的pH穩(wěn)定性較好，Hg2+、Cu2

5、+、Mn2+和SDS對(duì)酶抑制作用較為顯著，其水解蔗糖時(shí)Km為29.16 mM/L、最大反應(yīng)速度Vmax為0.34μM/min。所得β-呋喃果糖苷酶具有水解蔗糖以及轉(zhuǎn)移酶活力，其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)與水解菊粉表現(xiàn)一致。
　　成功克隆得到P6菌株部分β-呋喃果糖苷酶基因，命名為BFT1（登錄號(hào):KP857569），從該基因推導(dǎo)的氨基酸經(jīng)過氨基酸序列比對(duì)，確定其屬于β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase）(EC3.2.1.2

6、6)，是糖苷水解酶GH32家族的成員;為進(jìn)一步驗(yàn)證P6菌株水解菊粉與其β-呋喃果糖苷酶的關(guān)系，構(gòu)建β-呋喃果糖苷酶基因敲除載體，該敲除載體轉(zhuǎn)化到P6菌株細(xì)胞后，獲得的敲除菌株Q1;通過熒光定量PCR比較Q1敲除菌株和P6菌株BFT1基因的相對(duì)表達(dá)量，Q1菌株BFT1基因的表達(dá)量為P6菌株中BFT1基因表達(dá)量的5.69％。敲除菌株Q1與P6菌株相比，菊粉酶、蔗糖酶及轉(zhuǎn)移酶活力均有不同程度的下降，證實(shí)原始菌株P(guān)6表現(xiàn)出的菊粉酶活力與其自身的