β-呋喃果糖苷酶單克隆抗體的研制及其在蜂蜜摻假ELISA中的應(yīng)用.pdf

1、蜂蜜是蜜蜂從開(kāi)花植物的花中采得的花蜜在體內(nèi)經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化并吐回蜂巢中釀制成的。蜂蜜的成分除了葡萄糖、果糖外，還含有豐富的各種維生素、礦物質(zhì)和氨基酸。其味道甜蜜，所含的單糖不需要經(jīng)消化就可以被人體吸收，對(duì)婦、幼特別是老人更具有良好的保健作用，因而是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食品。蜂蜜的需求量很大，受利益驅(qū)使，近年來(lái)國(guó)內(nèi)蜂蜜摻假造假現(xiàn)象十分嚴(yán)重，危害消費(fèi)者身體健康，并嚴(yán)重阻礙中國(guó)蜂業(yè)的健康發(fā)展。
　　 檢測(cè)摻假蜂蜜的方法有很多，例如3C/12

2、C同位素比率分析法、高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法、雙果糖酐(DFAs)檢測(cè)法、高效液相色譜法、近紅外光譜法、旋光法、高效毛細(xì)管電泳等，但這些方法都或多或少的存在著設(shè)備要求高、操作復(fù)雜、鑒定類(lèi)型單一等缺點(diǎn)。而免疫學(xué)方法，特別是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，由于其具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，為蜂蜜摻假的檢測(cè)提供了新的思路。
　　 β-呋喃果糖苷酶（β-fructofurnosidase）是食品工業(yè)中用來(lái)

3、水解蔗糖的D-果糖β糖苷的果糖苷鍵的酶，在高濃度的蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶可催化轉(zhuǎn)糖基作用，在蔗糖的果糖基上通過(guò)β-(2，1)糖苷鍵連接1～3個(gè)果糖而形成果糖寡聚體。在低濃度蔗糖溶液中，β-呋喃果糖苷酶則主要是催化蔗糖水解，生成果糖和葡萄糖。如果將蔗糖水解后的果糖和葡萄糖摻入蜂蜜中，用一般的方法會(huì)難以鑒別，而通過(guò)檢測(cè)蜂蜜中摻入轉(zhuǎn)化糖而殘留的β-呋喃果糖苷酶有助于確定是否存在摻糖造假。
　　 本研究旨在建立一種快速、靈敏、簡(jiǎn)便

4、且經(jīng)濟(jì)的β-呋喃果糖苷酶酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法并將其應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)化糖類(lèi)的蜂蜜摻假檢測(cè)為目的。采用雜交瘤技術(shù)制備抗β-呋喃果糖苷酶單克隆抗體并建立雙抗夾心ELISA法檢測(cè)蜂蜜中β-呋喃果糖苷酶殘留的方法。通過(guò)對(duì)比不同來(lái)源的蔗糖轉(zhuǎn)化酶，分別采用考馬斯亮藍(lán)法和BCA法，SDS-PAGE測(cè)定其蛋白質(zhì)濃度和純度，結(jié)果表明每10mg蔗糖酶溶于1mL超純水中所得溶液蛋白濃度為5.6mg/mL，且純度很高。用其作為免疫原免疫小鼠后，采用雜交瘤技術(shù)獲得9株雜交

5、瘤細(xì)胞株，分別命名為1D6F2、8F8C5、8F8A9、1D6D12、8F8G3、8F8A6、8F8F10、1D6B10、1D6B11。用前四株制備4種腹水，制備的腹水效價(jià)基本在1:16，000以上，腹水以及包被抗原的工作濃度分別為1:16000和1:8000。通過(guò)相加實(shí)驗(yàn)測(cè)定8F8C5和8F8A9兩株是針對(duì)不同抗原表位，并以此為基礎(chǔ)建立雙抗夾心ELISA的檢測(cè)方法，檢驗(yàn)建立后的雙抗夾心ELISA法特異性良好，敏感性高，無(wú)明顯的交叉反應(yīng)