新霉素熒光偏振檢測方法的建立及應用.pdf

1、新霉素（Neomycin，NEO）屬于氨基糖苷類藥物。主要用來治療畜禽耳炎、皮炎等感染，雞白痢等疫病，還可以預防動物性疾病，并促進動物的生長發(fā)育，因價格低廉、效果明顯而在畜牧業(yè)中得到了廣泛應用。但長期使用，或超劑量用藥，能在動物組織中沉積、殘留，不僅會對動物健康造成危害，還會通過食物鏈危害消費者的健康。其危害性主要包括耳毒性、腎毒性以及神經(jīng)肌肉阻滯現(xiàn)象等。
　　新霉素殘留現(xiàn)有的檢測方法有微生物檢測方法、色譜檢測方法、免疫學檢測方法

2、等。在眾多檢測方法中，微生物法可通過半定量篩選實驗對食物中的獸藥殘留進行分析，但無法定量；薄層色譜法可分離多種物質(zhì)、成本低，但其結(jié)果易受主觀因素影響；高效液相色譜能夠為藥代動力學研究和其它調(diào)查研究提供所需的檢測特異性和靈敏度，但需要昂貴的儀器設(shè)備和熟練的操作人員；快速的酶聯(lián)免疫在精確測定復雜體系中的新霉素的含量時非常有用，但操作過程中需要反復洗滌及孵育，影響了檢測時間和效率。因此，構(gòu)建新霉素簡單、快速、特異的檢測方法是一個熱門研究方向。

3、
　　本論文擬通過新霉素人工抗原及單克隆抗體制備，結(jié)合熒光偏振技術(shù)，建立新霉素的熒光偏振免疫學檢測方法。本文主要包含以下幾個部分：
　　1.新霉素人工抗原的合成與鑒定
　　分析新霉素化學結(jié)構(gòu)，針對新霉素化學結(jié)構(gòu)中的氨基活性基團，選取牛血清蛋白（BSA）和雞卵清蛋白（OVA）作為載體蛋白，采用戊二醛法制備人工免疫原NEO-BSA和NEO-OVA。通過紫外掃描、SDS-PAGE電泳進行初步鑒定，動物免疫對人工抗原進行進一步

4、鑒定。紫外掃描結(jié)果顯示，偶聯(lián)產(chǎn)物與載體蛋白的吸收峰沒有重疊；SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，載體蛋白的遷移速率比偶聯(lián)產(chǎn)物快，由兩個實驗初步判定人工抗原偶聯(lián)成功；NEO-BSA所免疫小鼠的多抗血清效價都在1:6400以上，半數(shù)抑制濃度（IC50）為27.35ng/mL，表明偶聯(lián)的人工抗原具有良好的免疫原性，且能誘導動物機體產(chǎn)生針對新霉素的特異性抗體。
　　2.新霉素單克隆抗體的制備及鑒定
　　取 NEO-BSA免疫的小鼠中血清效

5、價及靈敏度最高的小鼠的脾細胞，通過細胞融合技術(shù)將其與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，采用間接酶聯(lián)免疫法對雜交瘤細胞進行篩選和亞克隆等一系列篩選實驗，篩選出3株能分泌抗新霉素單克隆抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為1E9、4E8、1G1，經(jīng)測定細胞上清效價均在1:6.4×103以上，選取效價較高的1E9雜交瘤細胞株用體內(nèi)誘生腹水法制備腹水。將得到的單抗進行純化，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳進行鑒定，判定純化成功。通過間接競爭ELISA測抑制，得到線

6、性回歸方程為y=-0.7398x+2.813的標準曲線，相關(guān)系數(shù)R2=0.9948，根據(jù)線性回歸方程可得IC50=1.338ng/mL。通過間接競爭ELISA對其特異性進行檢測，與其它氨基糖苷類藥物交叉反應率均低于0.01％，發(fā)現(xiàn)與其他藥物均無交叉。經(jīng)以上試驗驗證，成功制備了特異性高、靈敏度強的新霉素單克隆抗體，為熒光偏振檢測方法提供了所需抗體。
　　3.新霉素熒光偏振檢測方法的建立
　　將新霉素與熒光物質(zhì)異硫氰酸熒光素（F

7、ITC）偶聯(lián)，獲得示蹤物，采用TLC進行分離純化，分別經(jīng)甲醇及碳酸鹽緩沖液（CBS）萃取后，篩選出與抗體結(jié)合能力最佳的分離條帶，即Rf=0.4由CBS萃取得到的物質(zhì)。優(yōu)化示蹤物及抗體的工作濃度，對反應體系進行優(yōu)化，建立標準曲線，得到線性回歸方程Y=128.9+53.2/[(1+56.5/x)-1.175]，由方程可得IC50為56.5ng/mL，線性范圍為17.37ng/mL-183.92ng/mL，相關(guān)系數(shù)R2=0.9930。