池蝶蚌脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(HsLITAF)的分子結(jié)構(gòu)特征和功能分析.pdf

1、脂多糖誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子(Lipopolysaccharide-induced TNF-alpha factor，LITAF)可以調(diào)控TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，在無(wú)脊椎動(dòng)物的先天性免疫系統(tǒng)中扮演著重要的介質(zhì)作用。本研究根據(jù)池蝶蚌LITAF（以下簡(jiǎn)稱(chēng)HsLITAF）基因家族的部分EST序列，應(yīng)用RACE-PCR技術(shù)獲得3個(gè)池蝶蚌LITAF基因的cDNA全長(zhǎng)序列，分別命名為HsLITAF1、HsLITAF2、HsLITAF3,它們的c

2、DNA全長(zhǎng)分別為720bp，1115bp和688bp，分別可以編碼146，163和115個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，對(duì)應(yīng)的理論分子量為16.17，17.41和12.48KDa。分析發(fā)現(xiàn)，HsLITAFs與其它物種之間的LITAF蛋白存在著31％～94%不等的同源性和48%～100%的相似性。除HsLITAF3外其它兩個(gè)亞型均有兩個(gè)保守的CXXC基序；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析發(fā)現(xiàn)HsLITAF1與HsLITAF3發(fā)生了輕微的分化，與蝦夷扇貝的LITAF蛋白聚

3、為一類(lèi)；HsLITAF2和櫛孔扇貝、太平洋牡蠣的LITAF蛋白聚為一群，之后再與HsLITAF1和HsLITAF3聚在軟體動(dòng)物一支。
　　Realtime-PCR檢測(cè)3個(gè)基因的組織分布發(fā)現(xiàn)，三者呈現(xiàn)了不同的組織表達(dá)差異性，HsLITAF1和HsLITAF3在肝胰腺中表達(dá)量最高，HsLITAF2在鰓中表達(dá)量最高，但一致的是它們?cè)谘?xì)胞中的表達(dá)量都是最低的。通過(guò)閉殼肌注射LPS觀察3h、6h、12h、24h、48h不同時(shí)間段血細(xì)胞中的

4、應(yīng)答情況發(fā)現(xiàn)，3個(gè)HsLITAF基因在3h以后都發(fā)現(xiàn)了顯著的上調(diào)，HsLITAF1和HsLITAF3在24h后表達(dá)量達(dá)到最大值，HsLITAF2在48h后達(dá)到最值。這說(shuō)明HsLITAFs參與了池蝶蚌對(duì)LPS的免疫應(yīng)答。
　　CCK8檢測(cè)細(xì)胞體外增殖實(shí)驗(yàn)表明HsLITAF1、HsLITAF2、HsLITAF3基因不同程度的抑制了細(xì)胞的體外增殖，轉(zhuǎn)染3個(gè)基因之后的細(xì)胞增值率分別是空白組的71.46%，72.20%，77.06%。流式細(xì)

5、胞計(jì)數(shù)分析顯示，3個(gè)基因均不同程度的誘發(fā)了SMCC-7721的凋亡，分別達(dá)到46%，24.84%和12.84%。Realtime-PCR檢測(cè)HsLITAF1-3實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，結(jié)果顯示Bax基因分別上調(diào)1.43、1.41、1.29倍；Bcl-2基因分別下調(diào)到0.33倍，0.32倍，0.59倍；Caspase3基因分別上調(diào)1.80倍，3.05倍，1.40倍；P53基因分別上調(diào)7.04倍，7.92倍和3.10倍。這說(shuō)明HsLITAF

6、s可能是通過(guò)調(diào)控這些凋亡相關(guān)基因的表達(dá)誘導(dǎo)SMCC-7721細(xì)胞的凋亡。
　　對(duì)3個(gè)HsLITAF的亞細(xì)胞定位進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，HsLITAF1定位于細(xì)胞核中可能性最高為69.6%；HsLITAF2定位于細(xì)胞核中可能性最高為38.4%；HsLITAF3定位于細(xì)胞核中可能性最高為69.6%。進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)HsLITAF1和HsLITAF2在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，且主要在細(xì)胞核中有表達(dá)，但是HsLITAF3只在細(xì)胞質(zhì)中有表

7、達(dá)，這說(shuō)明生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)有一定的準(zhǔn)確性，HsLITAF3不能進(jìn)入細(xì)胞核可能與其丟失了C端的CXXC結(jié)構(gòu)有關(guān)，并且可能由此引發(fā)了HsLITAF3與HsLITAF1在功能上的差異化。
　　總之，HsLITAFs參與了池蝶蚌的先天免疫應(yīng)答，在組織中呈現(xiàn)應(yīng)答差異化；HsLITAFs可以調(diào)節(jié)P53，Bax，caspase3，Bcl2等基因表達(dá)不同程度的誘導(dǎo)SMCC-7721細(xì)胞的凋亡。HsLITAF3在丟失了CXXC結(jié)構(gòu)域后無(wú)法入核，可能