甲醛對類香草素受體的激活作用和甲醛誘導(dǎo)型哮喘分子機理的研究.pdf

1、近年來，關(guān)于室內(nèi)空氣甲醛污染與人體健康效應(yīng)的研究日益廣泛深入。甲醛引起的氣道神經(jīng)源性炎癥、獲得性過敏體質(zhì)現(xiàn)象等生物學(xué)效應(yīng)，都涉及甲醛觸發(fā)性生物靶分子介導(dǎo)的病理學(xué)過程。1991年丹麥學(xué)者G.D.Nielsen首先提出假說：室內(nèi)空氣污染物(如甲醛)所致的氣道刺激作用是一種受體介導(dǎo)的病理學(xué)過程，這種受體可能是辣椒素受體，現(xiàn)已證實辣椒素受體即為類香草素受體，它們分布于氣道黏膜中神經(jīng)末梢的細胞膜上。由于當(dāng)時和后來對這種膜受體蛋白本質(zhì)的認識還非常有

2、限，他所提出的假說一直沒有得到科學(xué)實驗的證實。1997年美國加洲大學(xué)DavidJulius教授課題組首次鑒定并命名了類香草素受體(vanilloidreceptorsubtype1,VR1)，他們構(gòu)建了大鼠感覺神經(jīng)元VR1重組質(zhì)粒，并成功地在人胚腎細胞(HEK-293細胞)和非洲爪蟾卵母細胞(Xenopuslaevisoocyte)中表達出VR1膜蛋白/離子通道，建立了VR1+重組細胞，進行了有關(guān)VR1的分子生物學(xué)、電生理學(xué)研究，并應(yīng)用

3、于疼痛傳導(dǎo)機制和分子藥理學(xué)的研究，其多篇研究論文在《Nature》和《Science》上發(fā)表。VR1+重組細胞的建立為檢驗和完善Nielsen假說提供了堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)。我們將該受體的研究引入環(huán)境醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，很可能導(dǎo)致對室內(nèi)空氣污染與疾病關(guān)系分子機理的研究(如甲醛誘導(dǎo)型哮喘)取得重要進展。 本課題就甲醛對VR1的激活作用開展了體外和體內(nèi)實驗研究，闡明甲醛觸發(fā)性生物靶分子的作用機理，驗證Nielsen假說的正確性；在此基礎(chǔ)上開展了甲醛

4、誘導(dǎo)型哮喘分子機理的實驗研究，結(jié)果如下： 1.VR1+-HEK293細胞模型的構(gòu)建和Nielsen假說的驗證為研究VR1作為室內(nèi)空氣污染物的觸發(fā)性生物靶分子的生理作用，在VR1-cDNA質(zhì)粒基礎(chǔ)上，應(yīng)用分子克隆和細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了體外培養(yǎng)的VR1+-HEK293細胞模型，并應(yīng)用此細胞模型進行辣椒素和甲醛致VR1+-HEK293細胞死亡實驗。結(jié)果表明，VR1+-HEK293細胞模型構(gòu)建成功，VR1+細胞死亡實驗是一種簡便有效的鑒定

5、VR1體外表達的實驗方法；甲醛能夠激活VR1，且激活反應(yīng)能被VR1特異性拮抗劑capsazepine所阻斷，從而推斷甲醛對氣道的刺激作用也可能是通過VR1所介導(dǎo)的。用體外細胞學(xué)實驗證實了VR1是甲醛作用的生物靶分子，以實驗證實了Nielsen假說的正確性。 2.非洲爪蟾卵母細胞電壓鉗實驗1997年DavidJulius教授課題組建立的VR1+細胞模型，將VR1從體內(nèi)錯綜復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中游離出來，使得利用體外細胞表達系統(tǒng)對其進

6、行針對性的全面深入研究成為可能。甲醛是否可以作為配體激活VR1，產(chǎn)生氣道刺激作用，通過第一套VR1信號傳遞系統(tǒng)(FA/VR1/Ca2+/SP/NKR)介導(dǎo)神經(jīng)源性炎癥，通過第二套VR1信號傳遞系統(tǒng)(FA/VR1/Ca2+/IL-4/IgE)導(dǎo)致機體獲得性過敏體質(zhì)的形成，以及其他的室內(nèi)空氣污染物，如可吸入顆粒物PM2.5、增塑劑鄰苯二甲酸酯(PAEs)等是否也可以激活VR1，介導(dǎo)上述毒性作用，電壓鉗實驗是最為有力的檢驗手段。由于電生理記錄

7、是技術(shù)難度最大操作最復(fù)雜的實驗環(huán)節(jié)，我們首先開展了非洲爪蟾卵母細胞內(nèi)源性ATP激活電流的研究。在帶有濾泡膜的非洲爪蟾卵母細胞中，記錄到了3種形式的電流，分別是ATP所激活的內(nèi)源性膜電流(IATP)的3個成分：快內(nèi)向電流(earlyfastdepolarizingcurrent，ID1)；較慢的內(nèi)向電流(lateslowdepolarizingcurrent，ID2)和緩慢的外向電流(slowhygerpolarizingcurrent，

8、IH)。其結(jié)果與李之望教授課題組報道的實驗結(jié)果一致，說明我們的電生理記錄是成功的。目前我們已完成體外轉(zhuǎn)錄、顯微注射和卵母細胞離體培養(yǎng)，預(yù)期得到VR1++非洲爪蟾卵母細胞，進行甲醛激活VR1電壓鉗實驗。 3.非致炎濃度的福爾馬林激活小鼠皮膚類香草素受體為探索非致炎濃度的福爾馬林對小鼠皮膚類香草素受體(VR1)的激活作用。我們選用雄性KM小鼠隨機分為3組：福爾馬林(formalin，F(xiàn)M)組、辣椒素(capsaicin，CAP)組和

9、Capsazepine(CPZ)組。采用注射后5min內(nèi)小鼠舔舐注射腳掌的時間作為評價疼痛反應(yīng)的指標，對各組小鼠分別進行疼痛學(xué)觀測。結(jié)果表明，0.025％FM和200μmol/LCAP是理想的實驗濃度，即既能引起顯著疼痛反應(yīng)，又不引起炎性損傷的致痛濃度，適于研究受體拮抗劑的抗疼痛作用；1μmol/LCPZ分別與200μmol/LCAP和0.025％FM共注射能有效的拮抗CAP和FM引起的疼痛反應(yīng)。我們推論，非致炎濃度FM所致的疼痛反應(yīng)在

10、外周可能是通過VR1介導(dǎo)的。福爾馬林實驗從體內(nèi)水平研究了甲醛對VR1的激活作用，也是電壓鉗等體外實驗的有力佐證。 4.獲得性過敏體質(zhì)：甲醛誘導(dǎo)型哮喘一種可能的發(fā)病機理近幾十年來世界范圍內(nèi)哮喘發(fā)病率不斷增長，尤其是西方發(fā)達國家。但是哮喘的發(fā)病機理并不清楚，近來室內(nèi)空氣污染物作為哮喘發(fā)病的誘發(fā)因素得到越來越多的研究。我們將25只雄性BALB/c小鼠隨機分為5組，分別進行氣態(tài)甲醛濃度為0，0.5，1.0，3.0mg/m3和3.0mg/

11、m3+Capsazepine預(yù)處理(CPZ，VR1特異性拮抗劑)的職業(yè)暴露模型(6h×10d)的處理，檢測肺泡灌洗液中過敏體質(zhì)的生物標志物IL-4和血清總IgE的水平。結(jié)果表明，小鼠BALF中IL-4的含量和血清總IgE的含量與氣態(tài)甲醛暴露水平呈劑量效應(yīng)關(guān)系，并且CPZ預(yù)處理3.0mg/m3甲醛暴露組與3.0mg/m3甲醛暴露組相比，IL-4和IgE水平顯著下降。我們推論，甲醛暴露可以通過第二套VR1信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(typeⅡVR1sig

12、nalingsystem)導(dǎo)致機體獲得性過敏體質(zhì)(acquiredatopy)的形成，從而可以易化哮喘的發(fā)生。以甲醛為代表的室內(nèi)空氣污染物可能是哮喘發(fā)病率增長的重要因素，而第二套VR1信號傳導(dǎo)系統(tǒng)是哮喘發(fā)病率增長的可能機制。 5.亞硝基谷胱甘肽還原酶(GSNOR)：甲醛誘導(dǎo)型哮喘一種新的可能的發(fā)病機理亞硝基谷胱甘肽還原酶(S-nitrosoglutathionereductase，GSNOR)是近年來頗受重視的蛋白質(zhì)分子，因為它

13、可以使亞硝基谷胱甘肽(S-nitrosoglutathione，GSNO)降解，而后者又是體內(nèi)對抗氣道高反應(yīng)性的重要生物活性分子。最新研究表明，氣道中的NO和“活性NO”(GSNO)的聯(lián)合作用具有重要的生理學(xué)和病理學(xué)作用。GSNOR可以調(diào)節(jié)NO和GSNO的平衡，非常有趣的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)GSNOR就是甲醛脫氫酶(formaldehydedehydrogenase，F(xiàn)DH)，F(xiàn)DH被認為是機體甲醛代謝的主要酶類。我們提出的假說：吸入的氣態(tài)甲醛

14、可以在基因水平上使GSNOR的表達上調(diào)，進而導(dǎo)致氣道中GSNO水平下降，氣道張力上升；當(dāng)存在哮喘的其他病原時，可以誘導(dǎo)哮喘發(fā)作。我們將18只雄性昆明小鼠隨即分成3組，進行連續(xù)72h濃度分別為0，1.0，3.0mg/m3的氣態(tài)甲醛染毒，采用RT-PCR檢測肺組織中GSNOR-mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，氣態(tài)甲醛能誘導(dǎo)GSNOR轉(zhuǎn)錄水平的上升，從而下調(diào)GSNO水平，且與我們前期研究氣態(tài)甲醛(1.0mg/m3以上)誘導(dǎo)肺組織NO水平升高的結(jié)果