基于單鏈可變區(qū)抗體的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫分析研究.pdf

1、擬除蟲菊酯類殺蟲劑是以天然除蟲菊素為先導(dǎo)物仿生合成的一類廣譜性殺蟲劑，具有光穩(wěn)定、高效、低毒、藥效時間長等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲、家用衛(wèi)生及畜禽養(yǎng)殖害蟲防治等領(lǐng)域，目前已與有機磷、氨基甲酸酯類農(nóng)藥并稱為使用最廣的三大農(nóng)藥。擬除蟲菊酯為神經(jīng)毒劑，對魚類、蜜蜂和家蠶的毒性較高，也是環(huán)境和人類健康潛在的威脅物。研究表明擬除蟲菊酯經(jīng)食物鏈的富集進(jìn)入人體內(nèi)可引發(fā)急性中毒或蓄積毒性，同時對機體的免疫及心血管系統(tǒng)有明顯毒害作用。近年來，擬除蟲菊酯

2、類農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留問題也逐步引起人們的重視，因此研究除蟲菊酯類農(nóng)藥新型殘留檢測技術(shù)具有重要意義。
　　本研究利用基因工程技術(shù)，對擬除蟲菊酯類農(nóng)藥單鏈可變區(qū)抗體進(jìn)行可溶性表達(dá)，建立并優(yōu)化了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫分析方法并對其進(jìn)行初步應(yīng)用，主要結(jié)果如下:
　　(1)成功獲得了擬除蟲菊酯類農(nóng)藥單鏈可變區(qū)抗體。利用基因工程技術(shù)，成功構(gòu)建兩個單鏈可變區(qū)抗體的原核表達(dá)載體即pET28a(+)-scFv和pET42a(+)-s

3、cFv，經(jīng)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)。誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果顯示通過BL21(DE3)/pET28a(+)-scFv獲得的單鏈抗體為無活性包涵體。重組菌BL21(DE3)/pET42a(+)-scFv經(jīng)0.1mM IPTG，15℃誘導(dǎo)表達(dá)15h后可獲得部分可溶形式的融合蛋白GS T/s cFv。此融合蛋白GST/scFv經(jīng)谷胱甘肽瓊脂糖樹脂GS Trap FF親和層析柱純化，再利用凝血因子Xa20℃酶切6h去除GST標(biāo)簽后，二次過柱純化產(chǎn)物

4、經(jīng)SDS-PAGE和Western blotting檢測，可知成功獲得條帶單一，相對分子質(zhì)量為28KDa的單鏈可變區(qū)抗體;經(jīng)間接非競爭酶聯(lián)免疫檢測，該單鏈可變區(qū)抗體的效價為1:2560。
　　(2)建立了適用于氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的IC-ELISA分析方法。以單鏈可變區(qū)抗體和半抗原h(huán)ap1為基礎(chǔ)，并以O(shè)Dmax和IC50為主要參數(shù)，對影響酶聯(lián)免疫反應(yīng)的多種因素進(jìn)行優(yōu)化，最終確定為:包被抗原（hap1-BSA）以5μg/mL的

5、濃度37℃包被酶標(biāo)板2h，單鏈可變區(qū)抗體稀釋640倍，抗原抗體稀釋液為pH7.4，含10％甲醇的PBST緩沖液，競爭時間為80min，HRP/Anti-His酶標(biāo)二抗稀釋7000倍使用。利用優(yōu)化后條件建立半抗原h(huán)ap1對單鏈抗體的抑制曲線為:I=24.463lgC+42.501，R2=0.9844，IC50為2.03μg/mL，最低檢測限IC10為0.046μg/mL，線性檢測范圍(IC20-IC80)為0.12～34.11μg/mL，

6、對單鏈抗體進(jìn)行交叉反應(yīng)實驗，結(jié)果顯示單鏈抗體對氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯有較強識別作用，抑制中濃度分別為3.29、4.73、5.55μg/mL;對聯(lián)苯菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯識別較差，對醚菊酯基本無識別能力。利用IC-ELISA對水樣中的氯菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯進(jìn)行添加回收，結(jié)果顯示在0.5～10μg/mL范圍內(nèi)，三者添加回收率均在82.60～104.01％之間，變異系數(shù)在2.71～6.38％之間，表明該單鏈抗體可用于水樣中三種菊酯