含氰基擬除蟲菊酯類農(nóng)藥多殘留免疫檢測方法的研究.pdf

1、農(nóng)藥殘留免疫檢測技術(shù)是國內(nèi)外小分子快速檢測的重要領(lǐng)域之一。本文針對含氰基擬除蟲菊酯類殺蟲劑，設(shè)計(jì)、合成了一種通用抗原，并制備得到了一種通用抗體。用自己制備的擬除蟲菊酯類農(nóng)藥中間體間苯氧基苯甲氰醇(CPBA)經(jīng)過一步衍生化，得到間苯氧基苯甲氰醇丁酸酯(CPBA-BE)，含有一個(gè)直鏈末端的羧基，用活性酯法在此羧基末端偶聯(lián)載體蛋白牛血清蛋白(BSA)作為免疫抗原(CPBA-BE-BSA)，用混合酸酐法在此羥基末端偶聯(lián)載體蛋白雞卵清蛋白(OVA

2、)作間接ELISA反應(yīng)的包被抗原(CPBA-BE-OVA)。用紫外/可見分光光度計(jì)對合成的人工抗原進(jìn)行全波長掃描，與半抗原和BSA、OVA的掃描結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示偶聯(lián)物具備半抗原和蛋白的雙重特征吸收峰，因此可以判斷偶聯(lián)成功，并估算免疫原和包被原的偶聯(lián)比分別為17.9和13.2。
　　 用上述合成的人工免疫抗原(CPBA-BE-BSA)免疫四只新西蘭大白兔，制備出四管抗血清，效價(jià)依次為102400、25600、25600、64

3、00，用效價(jià)最高的1號新西蘭大白兔的抗血清，針對與半抗原結(jié)構(gòu)最相似的氟胺氰菊酯，來建立間接ELISA檢測方法。包被原濃度為2μg/mL，抗體工作濃度為血清稀釋20000倍，在此工作濃度下對間接ELISA方法進(jìn)行系列優(yōu)化，最終得到最佳的工作條件為包被液為pH=9.6的碳酸鹽緩沖液，包被條件是4℃過夜，封閉液為含0.1%明膠的包被緩沖液，封閉時(shí)間為37℃2小時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為添加30%體積甲醇、pH=6.5的50mM PBS。一抗反應(yīng)時(shí)間和

4、二抗反應(yīng)時(shí)間都是30分鐘，顯液液配比為1:5，顯色時(shí)間為15分鐘。在此條件下作氟胺氰菊酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為Y=-0，2036X+1.2051，R2=0.9655；線性范圍為0.023-10μg/mL，IC50為2.884μg/mL。并在此條件對13種擬除蟲菊酯和代謝物進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，抗體除可以識(shí)別氟胺氰菊酯外還對代謝物間苯氧基苯甲酸(PBA)和氯氟氰菊酯的IC50分別為4.898μg/mL和9.772μg/mL，交叉反應(yīng)率分別為5