6種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥的抗雄激素作用及其機(jī)制.pdf

1、[目的]環(huán)境抗雄激素(EA)屬于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，是指原本存在于環(huán)境中、能通過多種分子機(jī)制產(chǎn)生拮抗雄激素反應(yīng)作用從而抑制雄性分化和性發(fā)育過程的一類化學(xué)物，大多數(shù)為雄激素受體(AR)拮抗劑。EA包括一些農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物、非甾體藥物、增塑劑等，其中農(nóng)藥及其代謝產(chǎn)物所占比例最大，同時(shí)也是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。擬除蟲菊酯類農(nóng)藥由于其廣譜、高效、低殘留、對(duì)人毒性較小等優(yōu)點(diǎn)在我國主要作為殺蟲劑得到廣泛應(yīng)用，暴露人群比較大，此類農(nóng)藥近年來逐漸成為抗雄激素

2、農(nóng)藥篩檢的重點(diǎn)，為了保障生殖健康，有必要對(duì)擬除蟲菊酯類可能的抗雄激素作用進(jìn)行研究。屬于此類的氯菊酯先前就被報(bào)道在體內(nèi)Hershberger試驗(yàn)中顯示有抗雄激素活性，本研究選取了氯菊酯、以及立體化學(xué)結(jié)構(gòu)與其相似的氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、高效氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯共6種農(nóng)藥，通過體內(nèi)Hershberger試驗(yàn)與體外穩(wěn)定轉(zhuǎn)染報(bào)告基因試驗(yàn)相結(jié)合的方法探討這6種擬除蟲菊酯的抗雄激素作用及其可能機(jī)制，為全面評(píng)價(jià)此類農(nóng)藥的安全性提供一定的科

3、學(xué)依據(jù)。 [方法]體外雄激素依賴基因轉(zhuǎn)錄活化試驗(yàn)采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因的人乳腺癌細(xì)胞株MDA-kb2細(xì)胞，該細(xì)胞株為美國國家環(huán)保局的Wilson教授所構(gòu)建，細(xì)胞本身就表達(dá)內(nèi)源性的AR。細(xì)胞在37℃、0％CO2環(huán)境條件下生長，所用培養(yǎng)基為含10％胎牛血清(活性炭處理去除甾體激素)的Leibovitz'sL-15。先行MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)，再根據(jù)此試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)雄激素依賴基因轉(zhuǎn)錄活化試驗(yàn)的測試劑量，試驗(yàn)時(shí)把細(xì)胞直接接種于96孔板，

4、等細(xì)胞貼壁后加入各種濃度受試物或已知抗雄激素處理細(xì)胞，同時(shí)加一定濃度的雙氫睪酮(DHT)來誘導(dǎo)熒光素酶基因的表達(dá)，誘導(dǎo)表達(dá)24h后裂解細(xì)胞，然后將熒光素酶測試液加入到細(xì)胞裂解液中，最后用1420多標(biāo)記計(jì)數(shù)儀測定熒光素酶活性值。試驗(yàn)中將羥基氟他胺作為拮抗劑陽性對(duì)照，同時(shí)用受試農(nóng)藥的溶媒作為溶劑對(duì)照，統(tǒng)計(jì)數(shù)值時(shí)以相對(duì)于溶劑對(duì)照組的熒光素酶活性值的倍數(shù)比值作為標(biāo)化熒光強(qiáng)度單位，來間接表示抗雄激素作用的大小。AR拮抗劑通過作用于AR抑制熒光素酶

5、報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。在預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上，正式試驗(yàn)至少重復(fù)2次，每次做4個(gè)平行樣品孔。體內(nèi)7天染毒Hershberger試驗(yàn)中，對(duì)適應(yīng)環(huán)境滿1周、4周齡大小的雄性SD大鼠行常規(guī)去勢手術(shù)(即雙側(cè)睪丸切除術(shù))，術(shù)后恢復(fù)2周。將經(jīng)去勢6周齡雄性大鼠隨機(jī)化分為受試農(nóng)藥低、中、高劑量組，溶劑對(duì)照組、睪酮缺乏組、陽性對(duì)照組，每組共5只。除睪酮缺乏組外每只大鼠每天皮下注射丙酸睪酮(TP)100μg(溶于0.2ml花生油)，連續(xù)7天。陽性對(duì)照組、溶劑對(duì)照和睪

6、酮缺乏組分別同時(shí)灌胃給予氟他胺50mg/(kg·d)、同體積花生油；染毒組分別灌胃給予聯(lián)苯菊酯1.5、4.5和13.5mg/(kg·d)，氯氰菊酯7、21、63mg/(kg·d)，高效氯氰菊酯6、18、54mg/(kg·d)，氟氯氰菊酯6、18、54mg/(kg·d)，高效氟氯氰菊酯4、12、36mg/(kg·d)，氯菊酯15、45、135mg/(kg·d)，灌胃體積均為5ml/kg。每天根據(jù)當(dāng)日所稱體重調(diào)整灌胃體積。最后一次染毒24h