原核表達(dá)之宿主菌株選擇指南

1、原核表達(dá)之宿主菌株選擇指南 原核表達(dá)之宿主菌株選擇指南在原核蛋白表達(dá)過程中，選擇構(gòu)建一個合適原核表達(dá)體系需要綜合考慮3大因素: 表達(dá)載體、宿主菌株、表達(dá)誘導(dǎo)條件，以獲得最滿意的表達(dá)效果。事實上，在平 時的實驗中，最容易被忽視的就是宿主菌的選擇一一多數(shù)人會直接選擇自己實驗 室曾經(jīng)用過的表達(dá)菌株，或者是載體配套的菌株，而不去追究原因一一即使表達(dá) 結(jié)果不佳，大多在表達(dá)條件和載體上找原因，也不會考究菌株的選擇是否適合。作為原核表達(dá)的宿主，對外

2、源基因的表達(dá)會產(chǎn)生一定的影響，是勿庸置疑的。每 一個宿主細(xì)胞都像一個微觀的小工廠，按照細(xì)胞固有的程序完成“你給它們安排 的生產(chǎn)任務(wù)”一一因為很難親眼觀察微觀世界中表達(dá)是如何進(jìn)行的，當(dāng)出現(xiàn)問題 時，我們需要經(jīng)驗判斷問題所在。宿主細(xì)胞對原核表達(dá)可能會產(chǎn)生哪些影響呢？知其然還要知其所以然。比如，菌株內(nèi)源的蛋白酶過多，可能會造成外源表達(dá)產(chǎn) 物的不穩(wěn)定，所以一些蛋白酶缺陷型菌株往往成為理想的起始表達(dá)菌株。堪稱經(jīng) 典的BL21系列就是和的夕7?蛋白

3、酶缺陷型，也是我們非常熟悉的表達(dá)菌株。 大名鼎鼎的BL21 （DE3）融源菌則是添加T7聚合酶基因，為T7表達(dá)系統(tǒng)而設(shè)計。真核細(xì)胞偏愛的密碼子和原核系統(tǒng)有不同，因此，在用原核系統(tǒng)表達(dá)真核基因的 時候，真核基因中的一些密碼子對于原核細(xì)胞來說可能是稀有密碼子，從而導(dǎo)致 表達(dá)效率和表達(dá)水平很低。改造基因是比較麻煩的做法，Rosetta 2系列就是更 好的選擇一一這種攜帶PRARE2質(zhì)粒的BL21衍生菌，補充大腸桿菌缺乏的七種（AUA, AGG

4、, AGA, CUA, CCC, GGA及CGG）稀有密碼子對應(yīng)的tRNA,提高外源 基因、尤其是真核基因在原核系統(tǒng)中的表達(dá)水平。（已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒） 當(dāng)要表達(dá)的蛋白質(zhì)需要形成二硫鍵以形成正確的折疊時，可以選擇K - 12衍生菌Origami 2系歹U, thioredoxin reductase (trxB) 和 glutathione reductase (gor) 兩條主要還原途徑雙突變菌株，顯著提高細(xì)胞質(zhì)中二硫鍵形成幾率

5、，促進(jìn)蛋白可 溶性及活性表達(dá)。（卡那霉素敏感）Rosetta-gami%26#8482; 2則是綜合上述兩類菌株的優(yōu)點，既補充7種稀有密碼 子，又能夠促進(jìn)二硫犍的形成，幫助表達(dá)需要借助二硫鍵形成正確折疊構(gòu)象的真 核蛋白。（卡那霉素敏感）Origami B是衍生自lacZY突變的BL21菌株，這個突變能根據(jù)IPTG的濃度精確 調(diào)節(jié)表達(dá)產(chǎn)物，使得表達(dá)產(chǎn)物量呈現(xiàn)IPTG濃度依賴性。（四環(huán)素敏感）在決定試用這些名字古怪的菌株時，有幾個小Ti

6、ps要注意的，一個是不同菌株 有時已經(jīng)攜帶某個質(zhì)粒或者已經(jīng)具有某種抗生素抗性，要注意自己的表達(dá)質(zhì)粒是 否能與之兼容。比如Rosetta 2已經(jīng)攜帶有氯霉素抗性質(zhì)粒，不能再用氯霉素 篩選等等。現(xiàn)象可能原因改進(jìn)方案建議菌株無蛋白表達(dá)于為目標(biāo)基因表達(dá)。誘導(dǎo)后幾 小時目標(biāo)產(chǎn)物就可超過細(xì)胞總蛋白的50%o新開發(fā)的T7驅(qū)動表達(dá)技術(shù)以pETBlueTM系統(tǒng)為代表。pETBlue載體包括了 pET用于表達(dá)的優(yōu)點，在目標(biāo)基因克隆和質(zhì)粒DNA操作的方面更為