鴨瘟強(qiáng)毒dUTPase基因的原核表達(dá)及在病毒感染宿主亞細(xì)胞定位研究.pdf

1、此文對(duì)本研究小組發(fā)現(xiàn)的DPVdUTPase基因(GenBank登錄號(hào)DQ486149)開展了以下系列研究：DPVdUTPase基因序列特征密碼子偏愛性分析、克隆、原核表達(dá)和抗體制備、在病毒感染宿主鴨胚成纖維細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物亞細(xì)胞定位檢測(cè)、轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時(shí)相分析、基于dUTPase蛋白的間接免疫熒光和間接免疫組化檢測(cè)石蠟切片中DPV方法的建立以及dUTPase在DPV強(qiáng)毒人工感染鴨組織中表達(dá)的動(dòng)態(tài)定位監(jiān)測(cè)等，結(jié)果如下： 1.鴨瘟病毒d

2、UTPase基因序列特征及密碼子偏愛性分析 DPVdUTPase基因大小為1344bp，編碼477aa，包含dUTPase家族蛋白的5個(gè)保守motifs(motiflPKRTEDAAYDI、motif2GRSS、Motif3GLIDSGYRG、motif4GDRIAQ、motif5RQFSGFGS)，排列形式3-1-2-4-5具備Ⅱ型dUTPase的典型特征。DPVdUTPase基因在33個(gè)皰疹病毒參考株間高度保守，與禽皰疹病毒

3、首先類聚，并與α皰疹病毒的氨基酸同源性較之與β、γ皰疹病毒要高。DPVdUTPase多肽鏈由61種密碼子編碼而成，密碼子的第三位偏愛于堿基A和T。DPVdUTPase基因與大腸桿菌、酵母及人的密碼子使用頻率比較，差值較大的大腸桿菌有19個(gè)，酵母有16個(gè)，人有15個(gè)。方差分析顯示DPVdUTPase基因密碼子與酵母差異極顯著(r=0.536，P＜0.01)。 2.dUTPase基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備 通過構(gòu)

4、建pET-32-DUT重組原核表達(dá)載體，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為66kD的重組融合蛋白，與預(yù)期表達(dá)的蛋白大小相一致。薄層掃描分析表明重組蛋白占菌體總蛋白的36.2％，主要以包涵體的形式存在。最佳表達(dá)優(yōu)化條件為0.8mmol/L的IPTG，30℃下誘導(dǎo)4～5h。利用純化的重組蛋白制備兔抗高免血清，間接ELISA效價(jià)為1:204800。兔抗dUTPaseIgG經(jīng)辛酸一硫酸銨鹽析和High-Q陰離子交換層析純化具高效、特異性強(qiáng)的

5、優(yōu)點(diǎn)。 3.DPV體外感染宿主細(xì)胞dUTPase基因轉(zhuǎn)錄及表達(dá)時(shí)相分析 RNADot-blot分析表明，最早可在感染后30min檢測(cè)到該基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，隨后轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量迅速放大，4h達(dá)高峰，一直持續(xù)到了感染后72h。這種轉(zhuǎn)錄譜具有皰疹病毒早期基因的典型特征。以制備的兔抗dUTPaseIgG為一抗，對(duì)感染鴨瘟強(qiáng)毒的DEF進(jìn)行Westernblot分析，感染后8～72h可檢測(cè)到觀察到與預(yù)測(cè)大小(約49kD)相一致的單一條帶，以感

6、染后12～24h反應(yīng)條帶濃度最大，并一直持續(xù)到感染后期。綜合分析DPVdUTPase基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)時(shí)相模式，推測(cè)該基因?yàn)椴《镜脑缙诨?，dUTPase的出現(xiàn)及其表達(dá)時(shí)相可能對(duì)晚期蛋白如衣殼蛋白、囊膜糖蛋白等的表達(dá)起激活作用，并與病毒的生長(zhǎng)周期密切相關(guān)。 4.DPVdUTPase基因產(chǎn)物在宿主細(xì)胞中的表達(dá)與亞細(xì)胞定位 通過細(xì)胞免疫熒光進(jìn)行病毒感染DEF的亞細(xì)胞定位檢測(cè)，結(jié)果表明特異性熒光可最早在感染后4h的胞質(zhì)中檢測(cè)到，1

7、2h大量點(diǎn)狀綠色熒光聚集于胞核；24h后胞核內(nèi)點(diǎn)狀熒光減弱而胞質(zhì)點(diǎn)狀熒光增強(qiáng)：48h胞核和胞質(zhì)熒光均顯著減弱。這種分布特征變化可初步推測(cè)為DPV基因組編碼的dUTPase在細(xì)胞質(zhì)中完成蛋白質(zhì)的合成，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核發(fā)揮其基本生物學(xué)功能，催化水解脫氧尿苷三磷酸(dUTP)和為DNA的合成提供必需的原料(dTTP)，維持高的dTTP/dUTP比率，阻止尿嘧啶插入到病毒DNA，在DNA合成的高保真度上起監(jiān)視作用。 5.DPVdUTPa

8、se在人工感染鴨組織的定位分析 用鴨瘟強(qiáng)毒感染成年鴨復(fù)制鴨瘟急性病例，分別于接種后不同時(shí)間，取心、肝、脾、腎、胸腺、腸道、法氏囊、腦等組織制作石蠟切片，進(jìn)行間接免疫熒光和間接免疫組化檢測(cè)DPVdUTPase在人工感染鴨組織的定位。結(jié)果表明：心、肝、脾、胰、肺、。腎、法氏囊、腦、胸腺、十二指腸、空腸、回腸、直腸、盲腸扁桃體、哈德氏腺免疫熒光呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性，氣管、肌肉、皮膚呈陰性。最早可在感染后2h檢測(cè)到少量DPVdUTPase抗原

9、位于大腦、盲腸扁桃體、法氏囊；12h后組織器官中的DPVdUTPase陽(yáng)性檢出率達(dá)50％以上，并在感染后4d達(dá)最高峰。病毒編碼dUTPase主要位于腦神經(jīng)細(xì)胞、肝細(xì)胞、免疫器官淋巴巨噬細(xì)胞等末端分化細(xì)胞中?？梢姡珼PV人工感染鴨后，首先對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)和免疫器官進(jìn)行攻擊，然后進(jìn)一步侵害全身各器官組織。病毒在感染早期大量編碼自身dUTPase，可能在一定程度上彌補(bǔ)了感染中后期因組織破壞及細(xì)胞功能喪失導(dǎo)致的(dUTPase不足，為保證病毒DNA復(fù)