基于膽紅素、膽酸鹽轉(zhuǎn)運體和代謝酶系統(tǒng)初探梔子退黃利膽作用的分子機制.pdf

1、目的：
　　通過考察梔子水提物對17α-炔雌醇誘導的大鼠肝內(nèi)膽汁淤積并發(fā)黃疸模型的治療作用，及其對體內(nèi)相關轉(zhuǎn)運體和代謝酶系統(tǒng)的影響，初步闡釋梔子水提物“退黃利膽”的分子機制。
　　方法：
　　健康Wistar雄性大鼠40只（200-220g），隨機分為正常組、模型組、梔子組和熊去氧膽酸（UDCA）組（n=10）。模型組、梔子組和UDCA組大鼠采用頸部皮下注射17α-炔雌醇（EE）誘導大鼠肝內(nèi)膽汁淤積并發(fā)黃疸模型，EE的

2、誘導周期和劑量為：共誘導14天，前7天為5mg/kg/d（qd）的注射劑量，后7天改為小劑量3mg/kg/d（qd）注射；正常組注射給予EE的溶媒丙二醇作為對照。誘導模型的同時：正常組和模型組灌胃給予生理鹽水（bid）連續(xù)14天；梔子組按臨床等效劑量（15g/kg/d原藥材）灌胃給予大鼠梔子水提取物（3g/kg/d,bid，每1g水提物相當于5g梔子原藥材）共14天；UDCA組灌胃給予UDCA（60mg/kg，bid）共14天。于第14

3、天第二次給藥結(jié)束后，每組再隨機選取5只大鼠置于代謝籠中收集12h的尿液和糞便并禁食，于次日收集尿液和糞便結(jié)束后，行膽管插管收集1h膽汁。此外，每組剩余的大鼠（n=5）同樣于第14日，第二次給藥結(jié)束后禁食12h，腹腔注射10％的烏拉坦麻醉后，腹主動脈采集血清樣本并處死，采集肝臟、腎臟和回腸組織。獲得樣本做相應處理后，分析測定：（1）血清中的谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）、總膽酸鹽（TBAs）、總膽紅素（T

4、BIL）、直接膽紅素（DBIL）和間接膽紅素（IBIL）濃度；（2）膽汁、糞便和尿液中的TBIL、DBIL、IBIL和TBAs的排泄總量；（3）肝臟和回腸中總膽酸鹽和12種膽酸鹽的濃度；（4）肝臟、回腸和腎臟部位膽紅素和/或膽酸鹽相關轉(zhuǎn)運體、代謝酶和核受體的mRNA表達。此外，通過顯微鏡下觀察大鼠肝臟病理切片，考察梔子對大鼠肝臟組織病理學的影響。
　　結(jié)果：
　　1.血清轉(zhuǎn)氨酶水平和肝臟病理學變化：與正常組相比，模型組大鼠血

5、清ALT、TBIL及TBAs水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組和正常組相比，給予梔子水提物后，大鼠血清ALT水平顯著下降并接近正常組水平（P＜0.05），TBAs存在下降的趨勢但并無顯著性差異，TBIL濃度顯著升高（P＜0.05）；與UDCA組相比，梔子組血清ALT和ALP水平均顯著降低。此外，肝臟組織病理學結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組大鼠的肝細胞出現(xiàn)了膽管擴張、炎性細胞浸潤及輕度脂肪變性等肝臟病變；而與模型組相比，梔子組和UDC

6、A組大鼠肝細胞病變程度均有所緩解，其表現(xiàn)為輕度炎性細胞浸潤。
　　2.體內(nèi)膽紅素的變化：（1）與正常組相比，模型組大鼠：血清中TBIL的濃度顯著升高了1.3倍，且以DBIL的顯著升高為主；TBIL、DBIL和IBIL經(jīng)1h膽汁及12h尿液排泄的總量均顯著升高（P＜0.05）；DBIL經(jīng)12h糞便排泄顯著升高（P＜0.05）。（2）梔子組與模型組相比：血清中TBIL含量顯著升高（P＜0.05），其中DBIL升高了近56%，IBIL上

7、升了3倍；膽汁及糞便中膽紅素的排泄并無顯著性變化；膽紅素經(jīng)12h尿液排泄的總量非常顯著性增加。（3）UDCA組與模型組相比：血清、膽汁、糞便和尿液中的膽紅素水平均無顯著變化。
　　3.體內(nèi)膽酸鹽的變化：（1）模型組與正常組相比：大鼠血清中的TBAs水平顯著升高（P＜0.05）；肝臟TBAs水平無顯著性變化，但其中GCA、CDCAs、CDCA、TCDCA，GLCA和GCDCA均顯著升高（P＜0.05），僅DCAs（主要為TDCA）和

8、TLCA顯著降低（P＜0.05）；回腸TBAs濃度下降為正常組的1/2，其中CA、CAs，TCA、DCA、DCAs和TDCA顯著下降（P＜0.05），GCDCA、LCA和GLCA顯著增加（P＜0.05）,腎臟TBAs水平增加了近9倍（P＜0.05）；膽汁和尿液TBAs排泄總量均顯著升高（P＜0.05）。（2）與模型組相比，梔子組大鼠：血清、肝臟、回腸、膽汁和糞便中的TBAs水平均無顯著性改變；肝臟中TCDCA，GCDCA和CDCAs的濃

9、度顯著下降；回腸中GCA、GCDCA和GLCA顯著下降；腎臟TBAs存在上升趨勢但并無統(tǒng)計學差異；經(jīng)尿液排泄的TBAs總量升高了1.3倍（P＜0.05）。（3）UDCA組與模型組相比：僅經(jīng)膽汁排泄的TBAs顯著增加P＜0.05），血清、肝臟、回腸、腎臟、糞便和尿液中的TBAs水平均無顯著性變化。
　　4.肝臟、回腸和腎臟中轉(zhuǎn)運體、代謝酶和核受體mRNA表達的變化：（1）在肝臟部位：與正常組相比，模型組Oatp2、Cyp3a2、Fg

10、f15和Ugt1a1的mRNA表達水平均顯著下調(diào)（P＜0.05），而Mrp2、Bsep、Cyp7a1、Cyp27a1和Shp的基因表達均顯著上調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，梔子組肝臟Ugt1a1的基因表達水平顯著上升，而Ntcp、Bsep、Cyp7a1、Cyp27a1和Shp的mRNA表達量顯著下降（P＜0.05）；UDCA組與模型組相比，Mrp3的基因表達量顯著降低（P＜0.05）。（2）在回腸部位：與正常組相比，模型組大鼠回腸O

11、stα/β及Fxr的mRNA表達水平顯著升高（P＜0.05），而Fgf15的表達量顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，梔子組回腸中Fxr基因表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05），而UDCA組Fgf15的mRNA表達量降低（P＜0.05）。（3）在腎臟部位：與正常組相比，模型組Mrp3、Mrp4的mRNA表達顯著升高（P＜0.05），而Asbt和Ostβ的基因表達量顯著下調(diào)（P＜0.05）；與模型組相比，梔子組腎臟部位Mrp3的表達下降（

12、P＜0.05），而Ostα/β，Mrp2和Mrp4的mRNA表達量顯著升高，其中Mrp2的表達上調(diào)了6倍，Mrp4上調(diào)了1.5倍；UDCA組與模型組相比，腎臟Ostβ和Mrp3的表達上調(diào)（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.EE誘導大鼠肝內(nèi)膽汁淤積并發(fā)黃疸模型的機制可能為：（1）肝臟膽紅素代謝酶Ugt1a1基因表達水平的下降可能是EE造成黃疸的主要原因；（2）肝臟合成酶Cyp7a1和Cyp27a1表達上調(diào)，從而介導初級膽酸

13、鹽合成增多，可能是長期給予EE后誘導膽酸鹽在大鼠體內(nèi)蓄積的原因。
　　2.梔子水提物主要通過：（1）上調(diào)肝臟代謝酶Ugt1a1，促進游離型膽紅素向更易于經(jīng)腎臟排泄的結(jié)合型膽紅素的轉(zhuǎn)變，（2）上調(diào)腎小管上皮細胞刷狀緣膜側(cè)的外排轉(zhuǎn)運體Mrp2的表達，（3）下調(diào)腎小管上皮細胞基底側(cè)膜介導膽紅素重吸收的轉(zhuǎn)運體Mrp3的表達，顯著增加膽紅素自尿液的排泄，從而發(fā)揮其“退黃”功效。
　　3.梔子水提物降低膽酸鹽在膽汁淤積大鼠體內(nèi)的蓄積，從