線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體在缺血預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、心肌缺血/復(fù)灌(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是臨床上常見的一種心肌損害現(xiàn)象。1986年Murry等發(fā)現(xiàn)，在對(duì)心肌進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間缺血前先對(duì)心肌進(jìn)行幾次短暫的非損傷性缺血后，心肌可耐受此后更長(zhǎng)時(shí)間的缺血，這種短暫的非損傷性缺血稱為缺血預(yù)處理(ischemicpreconditioning，IPC)，缺血預(yù)處理具有明顯的心肌保護(hù)作用。此后的研究發(fā)現(xiàn)，不僅僅在心臟局部進(jìn)行預(yù)處理可以對(duì)心臟產(chǎn)生保護(hù)作用，對(duì)遠(yuǎn)離心臟的器官進(jìn)行缺

2、血預(yù)處理同樣也可以減輕I/R對(duì)心肌造成的損傷，這一現(xiàn)象被稱為遠(yuǎn)距預(yù)處理(remotepreconditioning，RPC)的心肌保護(hù)作用。無(wú)論從何種形式看，缺血預(yù)處理都是可以對(duì)抗I/R心肌損傷的一種極為有效的手段。雖然已有大量的關(guān)于缺血預(yù)處理心肌保護(hù)作用的研究，但是其確切機(jī)理至今仍未完全闡明。 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，心肌線粒體內(nèi)鈣在心肌I/R損傷以及心肌預(yù)處理心肌保護(hù)中具有非常重要的作用，不僅I/R心肌損傷與線粒體內(nèi)鈣超載有密切的

3、關(guān)系，而且線粒體鈣穩(wěn)態(tài)在缺血預(yù)處理心肌保護(hù)中也具有非常重要的作用。線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體(mitochondrialcalciumuniporter，MCU)是位于線粒體內(nèi)膜上的一個(gè)重要的Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)體，可以將Ca2+從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體基質(zhì)，在線粒體能量代謝、線粒體Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)以及細(xì)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有非常重要的作用，因此我們推測(cè)，MCU有可能在心肌缺血/復(fù)灌損傷以及缺血預(yù)處理心肌保護(hù)中發(fā)揮重要作用，但是至今未見相關(guān)方面的研究報(bào)

4、道。 為了驗(yàn)證我們的假設(shè)，本研究分別利用離體心臟、離體心肌細(xì)胞、分離的心肌線粒體和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，重點(diǎn)對(duì)MCU在缺血預(yù)處理(包括經(jīng)典預(yù)處理和遠(yuǎn)距預(yù)處理)心肌保護(hù)中的作用及機(jī)制進(jìn)行了探討。 目的1.觀察MCU在缺血/復(fù)灌心肌損傷中的作用； 2.觀察MCU在經(jīng)典的缺血預(yù)處理和遠(yuǎn)距預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用； 3.研究MCU對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrialpermeabilitytransitionp

5、ore,MPTP)的調(diào)控以及這種調(diào)控在缺血預(yù)處理心肌保護(hù)中的地位； 4.研究?jī)?nèi)源性阿片受體激活在遠(yuǎn)距預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用，MCU及其MPTP的調(diào)控在阿片受體介導(dǎo)的遠(yuǎn)距預(yù)處理中的作用。 方法1.用Langendorff灌流裝置記錄離體心臟心室收縮功能及心率； 2.用整體及離體心臟缺血/復(fù)灌模型觀察MCU活動(dòng)在其中的作用； 3.應(yīng)用局部預(yù)處理和遠(yuǎn)距預(yù)處理模型觀察MCU活動(dòng)在預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用；

6、4.用TTC染色法測(cè)量心肌梗死面積； 5.用分光光度法檢測(cè)冠脈流出液和血漿乳酸脫氫酶(lactatedehydrogenase，LDH)活性以及分離的線粒體標(biāo)志酶活性； 6.電鏡觀察分離的線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)； 7.原子吸收分光光度法檢測(cè)線粒體內(nèi)鈣含量； 8.用線粒體腫脹法在分離的線粒體上檢測(cè)MPTP開放； 9.用激光共聚焦顯微術(shù)在分離的心肌細(xì)胞上檢測(cè)MPTP開放； 10.用放射免疫法檢測(cè)血漿強(qiáng)

7、啡肽和腦啡肽的水平。 結(jié)果第一部分線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)在心肌缺血/復(fù)灌損傷中的作用1.在離體灌流的心臟和在體心臟上，分別用MCU抑制劑釕紅(rutheniumred，RR，5μmol/L)和RR(2.5mg/kg)抑制MCU的活動(dòng)，提高了I/R后心室收縮功能的恢復(fù)，減小了心肌梗死面積，減小了冠脈流出液以及血漿中LDH活性。 2.在離體灌流的心臟和在體心臟上，分別用MCU激動(dòng)劑Spermine(Sper，20μmol/L

8、)和Sper(5mg/kg)激動(dòng)MCU，增加了冠脈流出液和血漿中LDH活性，心室收縮功能恢復(fù)和心肌梗死面積同I/R相比均無(wú)明顯差異。 3.在體實(shí)驗(yàn)中，缺血后各組大鼠的平均動(dòng)脈壓(meanarterypressure，MAP)和心率(heartrate，HR)均減低，復(fù)灌后各組MAP與HR均有不同程度的恢復(fù)，但各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二部分線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)在缺血預(yù)處理中的作用1.IPC明顯減小了I/R引起的心肌梗死面

9、積和冠脈流出液中LDH活性，復(fù)灌期心室收縮功能恢復(fù)程度明顯增高。 2.MCU激動(dòng)劑Sper(20μmol/L)取消了IPC的心肌保護(hù)作用，用特異的MCU抑制劑Ru360(10μmol/L)或RR(5μmol/L)預(yù)先處理可模擬IPC的心肌保護(hù)效應(yīng)。 3.肢體RPC明顯減小了I/R心肌的梗死面積和血漿中LDH的含量。在進(jìn)行肢體RPC前用Sper(5mg/kg)激動(dòng)MCU，結(jié)果取消了RPC的心肌保護(hù)作用。 4.缺血后

10、各組大鼠的MAP和HR均減低，復(fù)灌后各組MAP有不同程度的恢復(fù)，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第三部分線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體對(duì)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的調(diào)控作用1.電鏡下觀察到分離的心肌線粒體在腫脹前內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)完整，線粒體電子密度較高，而線粒體腫脹后外膜破裂，內(nèi)嵴明顯消失。 2.分離的線粒體內(nèi)膜標(biāo)志酶琥珀酸脫氫酶和外膜標(biāo)志酶單胺氧化酶的功能活性明顯高于細(xì)胞漿。 3.在分離的心肌線粒體，MCU抑制劑RR(1μmol/L)或Ru360

11、(10μmol/L)抑制了MPTP的開放；用MCU的激動(dòng)劑Sper(20μmol/L)增強(qiáng)了MPTP的開放。用MPTP的特異阻斷劑環(huán)孢菌素A(cyclosopirneA，CsA)完全取消了后一作用。 4.在分離的calcein負(fù)載的心肌細(xì)胞，MCU抑制劑RR(5μmol/L)取消了Ca2+誘發(fā)的線粒體calcein熒光的迅速降低，而激動(dòng)劑Sper(20μmol/L)卻使心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)calcein熒光的下降程度增加。

12、5.I/R和Sper處理明顯增加了線粒體Ca2+含量，用RR(5μmol/L)抑制MCU和IPC均明顯減小了I/R引起的線粒體內(nèi)Ca2+的升高，而IPC的作用可被Sper所阻斷。 6.復(fù)灌期用RR抑制MCU活動(dòng)明顯減少了I/R引起的線粒體ROS的產(chǎn)生，而用Sper激動(dòng)MCU使線粒體ROS的產(chǎn)生顯著增加。 第四部分線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體—線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔調(diào)控在預(yù)處理心肌保護(hù)中的作用1.用MPTP特異阻斷劑CsA阻斷了MCU激

13、動(dòng)劑Sper對(duì)IPC心肌保護(hù)效應(yīng)的取消作用。 2.在經(jīng)過預(yù)處理后分離的大鼠心肌線粒體在520nm下的吸光度下降程度和速率與未經(jīng)預(yù)處理的心肌線粒體相比明顯減小。 3.用κ阿片受體激動(dòng)劑U-50,488H(10mg/kg)或用內(nèi)源性κ阿片受體激動(dòng)劑強(qiáng)啡肽(300pg/ml)激動(dòng)心肌κ阿片受體明顯減小了心肌梗死面積，降低了血.漿中LDH的含量。RPC后血漿強(qiáng)啡肽的水平明顯升高。 4.用κ阿片受體阻斷劑nor-BNI(1

14、0mg/kg)阻斷了RPC和U-50,488H的心肌保護(hù)作用。 5.δ阿片受體阻斷劑那曲吲哚(1mg/kg)對(duì)RPC的心肌保護(hù)作用無(wú)明顯影響；RPC后血漿中δ阿片受體內(nèi)源性激動(dòng)劑腦啡肽的水平未見明顯變化。 6.MPTP開放抑制劑CsA取消了nor-BNI對(duì)RPC的阻斷作用；MPTP開放劑Atr(5mg/kg)則阻斷了RPC和U-50,488H的心肌保護(hù)作用。 結(jié)論1.抑制線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)體活動(dòng)可對(duì)抗心肌缺血/復(fù)灌