腦紅蛋白在肢體缺血預(yù)處理腦保護(hù)中的作用及其機(jī)制.pdf

1、缺血性腦病具有發(fā)病率、致殘率和死亡率高的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類的健康。且近年來其發(fā)病率呈不斷上升的趨勢，隨著我國老齡化社會的到來，形勢將更加嚴(yán)峻。調(diào)動機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制提高神經(jīng)細(xì)胞對缺血性損害的抵抗力作為缺血性腦病防治的新策略，受到醫(yī)學(xué)界的高度重視。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用大鼠四血管閉塞全腦缺血整體動物模型，觀察Ugb在LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受中表達(dá)的變化、以及上調(diào)或阻斷Ngb表達(dá)對LIP腦保護(hù)作用的影響，探討Ngb在LIP抗腦缺血/再灌注損傷中的作用；在

2、此基礎(chǔ)上，從線粒體的結(jié)構(gòu)和功能以及線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑等方面探討Ngb在LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受中的線粒體機(jī)制；并進(jìn)一步觀察青年和老年大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)的變化及LIP對其影響，以及LIP對正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)的影響，為全面深入地評價(jià)腦缺血后海馬Ngb表達(dá)的變化及LIP的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上腦血管疾病的防治研究提供新線索和思路。
　　 1.Ngb參與LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受
　　 目的：

3、觀察ngb在LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受中表達(dá)的變化、以及應(yīng)用Ngb誘導(dǎo)劑Hemin和Ngb AS-ODNs分別上調(diào)和抑制Ngb表達(dá)對LIP腦保護(hù)作用的影響，確定Ngb在LIP誘導(dǎo)的大鼠腦缺血耐受中的作用。
　　 1.1 LIP上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)
　　 結(jié)果：RT-PCR.和Western blot分析顯示，腦缺血sham組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白有一定的表達(dá)。與腦缺血sham組相比，LIP組Nab

4、mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加。腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達(dá)較腦缺血sham組明顯下降。與腦缺血sham組和腦缺血組相比，LIP+腦缺血組Ngb mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，而LIP sham+腦缺血組Nab表達(dá)則無明顯變化。
　　 結(jié)果表明，LIP可誘導(dǎo)腦缺血耐受，同時(shí)上調(diào)腦內(nèi)Ngb的表達(dá)。
　　 1.2 Hemin上調(diào)Ngb表達(dá)誘導(dǎo)腦缺血耐受
　　 結(jié)果：RT-PCR和Western blot分

5、析顯示，與腦缺血sham組相比，腦缺血組和Hemin溶劑+腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達(dá)顯著下降。與腦缺血組和Hemin溶劑+腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組Ngb mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，尤以20 mg/kg和40 mg/kg組明顯，并呈現(xiàn)劑量依賴性。
　　 結(jié)果表明，Hemin可上調(diào)Ngb表達(dá)而誘導(dǎo)腦缺血耐受。
　　 1.3 Blgb AS-ODNs抑制LIP抗腦缺血引起的海馬CA1區(qū)DND的作

6、用
　　 結(jié)果：Western blot分析顯示，與ACSF+LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組海馬CA1區(qū)Ngb蛋白表達(dá)顯著降低，并與AS-ODNs的劑量呈現(xiàn)依賴性，而LIP前側(cè)腦室注射S-ODNs，對CA1區(qū)Ngb蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　 結(jié)果表明，NgbAS-ODNs可阻斷Ngb表達(dá)，進(jìn)而阻斷LIP的腦保護(hù)作用。
　　 1.4 LIP和Hemin降低腦缺血引起的血清Ngb蛋白含量增加<

7、br>　　 結(jié)果：ELISA顯示，腦缺血sham組和LIP組血清Ngb蛋白含量較低，二者之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與腦缺血sham組相比，腦缺血組血清Ngb蛋白含量顯著增加。而腦缺血前給予LIP預(yù)處理，血清Ngb蛋白含量明顯下降。與腦缺血組相比，Hemin（20 mg/Kg）+腦缺血組血清Ngb蛋白含量明顯下降；而Hemin溶劑+腦缺血組血清Ngb蛋白含量無明顯變化。
　　 以上結(jié)果表明，LIP和Hemin可明顯降低腦缺血后血清Ngb

8、蛋白含量升高。
　　 2.Ngb通過線粒體機(jī)制參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受
　　 目的：通過觀察Ngb表達(dá)增加對海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體Na+-K+-ATP酶活性、神經(jīng)元及線粒體超微結(jié)構(gòu)、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)的影響，探討Ngb是否通過線粒體機(jī)制參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 結(jié)果：流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位顯示，腦缺血sham組海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位較高。與腦缺血s

9、ham組相比，腦缺血后線粒體膜電位顯著降低。與腦缺血組相比，LIP+腦缺血組線粒體膜電位明顯增加。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組線粒體膜電位顯著降低，而S-ODNs+LIP+腦缺血組則無明顯變化。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組線粒體膜電位明顯增高，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。
　　 海馬CA1區(qū)線粒體Na+-K+-ATP酶活性測定顯示，在6 h時(shí)間點(diǎn)，腦缺血sham組該酶活性較高，而腦

10、缺血后則較腦缺血sham組明顯下降。與腦缺血組相比，LIP+腦缺血組該酶活性明顯下降。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組該酶活性顯著增加，而LIP前側(cè)腦室注射Ngb S-ODNs，對該酶活性無影響。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組該酶活性明顯降低，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。在24 h時(shí)間點(diǎn)，腦缺血sham組線粒體Na+-K+-ATP酶活性較高。與腦缺血sham組相比，腦缺血后該酶活性顯著下降。與腦

11、缺血組相比，LIP+腦缺血組該酶活性明顯增加。與LIP+腦缺血組相比，AS-ODNs+LIP+腦缺血組該酶活性顯著降低，而S-ODNs+LIP+腦缺血組則無明顯變化。與腦缺血組相比，Hemin+腦缺血組該酶活性明顯增加，而Hemin溶劑+腦缺血組則無明顯變化。
　　 結(jié)果表明，Ngb表達(dá)增加可通過調(diào)控海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體膜電位、Na+-K+-ATP酶活性、線粒體超微結(jié)構(gòu)、Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)等線粒體機(jī)制參與LI

12、P誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 3.青年和老年大鼠腦缺血后海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)的變化及LIP對其影響
　　 目的：觀察比較青年和老年大鼠腦缺血時(shí)海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)的變化及LIP對其影響，為進(jìn)一步評價(jià)腦缺血后海馬Ngb表達(dá)的變化及LIP的保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 結(jié)果：RT-PCR分析顯示，Ngb和GAPDH擴(kuò)增后的產(chǎn)物片段與設(shè)計(jì)相符。老年腦缺血組Ngb mRNA表達(dá)比青年腦缺血組明顯降低。LIP可明顯上調(diào)青

13、年和老年大鼠腦缺血后Ngb的mRNA表達(dá)，但老年大鼠（LIP+老年腦缺血組）的上調(diào)幅度小于青年大鼠（LIP+青年腦缺血組）。
　　 Western blot結(jié)果顯示，各組均可在分子量相當(dāng)于17KD和42KD的區(qū)域見Ngb和β-actin蛋白表達(dá)條帶。Ngb蛋白表達(dá)在老年大鼠腦缺血組比青年大鼠腦缺血組顯著降低，LIP后青年和老年腦缺血大鼠Ngb的蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，但老年大鼠（LIP+老年腦缺血組）的上調(diào)幅度小于青年大鼠（LIP+

14、青年腦缺血組）。
　　 結(jié)果表明，老年大鼠全腦缺血后Ngb的表達(dá)及LIP對其上調(diào)作用較青年大鼠明顯減弱，這可能是老年大鼠腦缺血后損傷較重和LIP對老年大鼠腦缺血保護(hù)作用較弱的原因之一。
　　 4.LIP上調(diào)正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)
　　 目的：觀察LIP后不同時(shí)間點(diǎn)正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb表達(dá)的變化，為研究和評價(jià)LIP對正常機(jī)體的腦保護(hù)作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 結(jié)果：RT-PCR分析顯示，在150

15、bp和349bp處分別為Ngb和內(nèi)參GAPDH的擴(kuò)增條帶。Sham組海馬CA1區(qū)有一定的Ngb mRNA表達(dá)。與sham組相比，LIP后海馬CA1區(qū)Ngb mRNA.表達(dá)增加。這種增加于LIP后30 min最明顯，隨后逐漸下降，在6 h時(shí)接近sham組水平。
　　 Western blot結(jié)果顯示，各組均可在分子量相當(dāng)于17KD和42KD的區(qū)域分別出現(xiàn)Ngb和β-actin蛋白表達(dá)條帶。Sham組海馬CA1區(qū)有一定的Ngb蛋白表

16、達(dá)。與sham組相比，LIP后海馬CA1區(qū)Ngb蛋白表達(dá)增加。這種增加于LIP后1 h達(dá)到高峰，隨后逐漸下降，至1 d時(shí)接近sham組。
　　 以上結(jié)果表明，LIP能上調(diào)正常大鼠海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達(dá)，Ngb mRNA表達(dá)高峰早于蛋白表達(dá)高峰。
　　 5.結(jié)論
　　 （1）LIP能明顯上調(diào)腦缺血大鼠海馬CA1區(qū)Ngb mRNA和蛋白表達(dá)，同時(shí)LIP可明顯抑制腦缺血后CA1區(qū)錐體神經(jīng)元DND，降低血

17、清Ngb蛋白含量；腹腔注射Ngb誘導(dǎo)劑Hemin能模擬LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受，而側(cè)腦室注射Ngb AS-ODNs可部分阻斷LIP的腦保護(hù)作用。這些結(jié)果表明，Ngb表達(dá)上調(diào)在LIP誘導(dǎo)腦缺血耐受中發(fā)揮重要作用。
　　 （2）Ngb表達(dá)增加通過增加線粒體膜電位、改善線粒體Na+-K+-ATP酶活性、保護(hù)線粒體超微結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)等線粒體機(jī)制參與LIP誘導(dǎo)的腦缺血耐受。
　　 （3）老年大鼠全腦缺血后