腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷病理過(guò)程中的作用研究.pdf

1、研究背景腦挫裂傷是常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，是當(dāng)今威脅人類(lèi)生命的主要疾病之一。在醫(yī)學(xué)不斷進(jìn)步的今天，腦挫裂傷的致殘、致死率卻一直居高不下，至今仍沒(méi)有一項(xiàng)十分有效的治療方法。因此，從腦挫裂傷發(fā)病機(jī)制出發(fā)，研究其致病因子對(duì)于臨床實(shí)踐十分重要。
　　 腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)是新近發(fā)現(xiàn)的一種主要位于神經(jīng)元內(nèi)、能夠可逆性結(jié)合氧的球蛋白，它是一個(gè)新的內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)因子。目前研究表明，Ngb對(duì)腦缺血缺氧具有保護(hù)作用。熱休克蛋白6

2、0(Heat Shock Protein60，HSP60)主要定位于細(xì)胞線粒體內(nèi)，生理狀態(tài)下，HSP60協(xié)助細(xì)胞多肽或蛋白質(zhì)正確轉(zhuǎn)位、折疊和裝配，當(dāng)受到不良刺激時(shí)，HSP60的表達(dá)明顯增加，維持細(xì)胞內(nèi)必需蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象，從而保護(hù)細(xì)胞生命活動(dòng)，確保細(xì)胞生存。為了探究Ngb及HSP60在腦挫裂傷的病理過(guò)程中所起的作用，我們做了一些研究。
　　 本課題共分為三個(gè)部分:
　　 第一章腦挫裂傷患者腦組織及血中白細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組的

3、表達(dá);
　　 第二章Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者腦組織中的表達(dá);
　　 第三章Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者血清中的表達(dá)。
　　 第一章腦挫裂傷患者腦組織及血中白細(xì)胞差異蛋白質(zhì)組的表達(dá)
　　 目的:通過(guò)雙向凝膠電泳技術(shù)建立腦挫裂傷組和正常對(duì)照組分辨率高、重復(fù)性好的腦組織及血中白細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，探討其功能和作用。
　　 方法:分別采集10例腦挫裂傷患者和10例正常腦

4、組織及血液標(biāo)本，應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液分離白細(xì)胞，再運(yùn)用二維凝膠電泳技術(shù)提取腦組織及白細(xì)胞的蛋白質(zhì)，用PDquest圖像分析軟件識(shí)別差異蛋白質(zhì)點(diǎn)，MADLI-TOF和生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定和分析。
　　 結(jié)果:通過(guò)PDQuest7.0分析軟件進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，分別獲得腦組織及白細(xì)胞的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)，在腦組織部分:正常組為(764±28)個(gè)，腦挫裂傷組(753±19)個(gè)。通過(guò)和正常對(duì)照組進(jìn)行比較，可發(fā)現(xiàn):腦挫裂傷組中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有15

5、個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有16個(gè)。經(jīng)過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，取9個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，在9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有7個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定，它們?yōu)榱蜓踹€蛋白(Thioredoxin，Trx)，泛素羥基端水解酶L1(Ubiquitincarboxy-terminal hydrolase isozyme L1， UCH-L1)，腦紅蛋白(Neuroglobin，Ngb)，NSFL1輔助因子p47(NSFL1 cofactor p47

6、)，微管蛋白α鏈(Microtubulin alpha chain)，二氫嘧啶酶相關(guān)蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2)，突觸小體膜聯(lián)合25K蛋白（Synaptosomal associated25K protein）。在白細(xì)胞部分:正常組為(572±18)個(gè)，腦挫裂傷組(518±16)個(gè)。與正常組比較分析，腦挫裂傷組中表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有21個(gè)，表達(dá)下調(diào)的蛋白質(zhì)點(diǎn)有17個(gè)。經(jīng)過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

7、庫(kù)比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，取9個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行了鑒定。結(jié)果顯示，在9個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)中有6個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)得到鑒定，它們?yōu)殁}網(wǎng)織蛋白前體(Calreticulin precursor)、熱休克蛋白60(Heat ShockProtein60，HSP60)、鈣依賴性蛋白激酶(Calcium-dependent proteinkinase)、脂酰輔酶A脫氫酶(Fatty acyl-coa dehydrogenase)、谷氨酸脫氫酶前體（Glutamate

8、dehydrogenase precursor）和醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase)。
　　 結(jié)論:1、通過(guò)雙向凝膠電泳技術(shù)初步建立了腦挫裂傷組及正常對(duì)照組腦組織及白細(xì)胞蛋白質(zhì)組表達(dá)圖譜;
　　 2、經(jīng)過(guò)凝膠圖像分析，腦挫裂傷組及正常對(duì)照組腦組織及白細(xì)胞二維凝膠電泳圖譜的表達(dá)具有明顯差異;
　　 3、經(jīng)過(guò)與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)比較及質(zhì)譜技術(shù)分析，鑒定出的差異蛋白質(zhì)有可能通過(guò)細(xì)胞分裂、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、蛋

9、白質(zhì)降解通路、氧化還原反應(yīng)等參與腦挫裂傷的病理過(guò)程，其中Ngb及HSP60在腦挫裂傷的病理過(guò)程可能起著重要作用。
　　 第二章腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷患者腦組織中的表達(dá)
　　 目的:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腦挫裂傷患者組及正常對(duì)照組腦組織中Ngb及Hsp60的表達(dá)，研究Ngb及Hsp60在腦挫裂傷患者組及正常對(duì)照組的表達(dá)差異，評(píng)價(jià)Ngb及Hsp60在腦挫裂傷的病理過(guò)程的作用。
　　 方法:采用SP法，按

10、照北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供的SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。本研究切取10例成年腦挫裂傷患者（受傷部位均為右額葉）額葉皮層組織標(biāo)本，以10例成年腦室腫瘤患者行腫瘤切除術(shù)取得的正常額葉皮層組織標(biāo)本為正常對(duì)照。然后按照SP試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行切片、脫蠟及水化、漂洗及蒸餾水洗滌、微波修復(fù)、加入一、二抗孵育、光鏡下觀察、蘇木素襯染、樹(shù)膠封片、光鏡下觀察切片染色情況并拍照。
　　 結(jié)果:1.免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示Ngb表達(dá)定位于胞漿內(nèi)，胞漿內(nèi)淺棕

11、色物質(zhì)即為Ngb檢測(cè)陽(yáng)性。在正常腦組織中Ngb呈弱陽(yáng)性表達(dá)，腦挫裂傷灶腦組織呈陽(yáng)性表達(dá);而挫裂傷灶周?chē)咏５哪X組織中Ngb表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與正常對(duì)照組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2.免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示HSP60表達(dá)定位于胞漿內(nèi)，胞漿內(nèi)淺棕色物質(zhì)即為HSP60檢測(cè)陽(yáng)性。在正常腦組織中HSP60呈陽(yáng)性表達(dá)，在腦挫裂傷灶腦組織呈陽(yáng)性表達(dá)，而腦挫裂傷灶周?chē)咏５哪X組織中HSP60表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，與正常對(duì)照組比較

12、有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:腦挫裂傷灶周?chē)咏５哪X組織Ngb及HSP60表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性，提示Ngb及HSP60在腦挫裂傷病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 第三章腦紅蛋白及熱休克蛋白60在腦挫裂傷患者血清中的表達(dá)
　　 目的:應(yīng)用免疫印跡方法檢測(cè)腦挫裂傷患者組及正常對(duì)照組血清中Ngb及HSP60的表達(dá)，研究Ngb及HSP60在腦挫裂傷患者組及正常對(duì)照組血清中的表達(dá)差異，評(píng)價(jià)Ngb及HSP60

13、在腦挫裂傷的病理過(guò)程的作用。
　　 方法:參照《現(xiàn)代細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)》操作。10例腦挫裂傷患者血清均為腦外傷后未經(jīng)手術(shù)治療患者的血清，正常人血清由年齡和性別匹配的10例志愿者提供。血清樣本稀釋10倍后，測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度，再進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以一抗、二抗孵育，用ECL試劑發(fā)光及顯影，并以膠中非目的蛋白質(zhì)條帶作為上樣量對(duì)照。再經(jīng)掃描獲取圖像，用圖像分析軟件確定其灰度值，分析特異蛋白的表達(dá)水平。
　

14、　 結(jié)果:1.在正常人血清中Ngb呈低表達(dá);腦挫裂傷后3小時(shí)血清中Ngb表達(dá)升高，在12小時(shí)后Ngb達(dá)到峰值，其后表達(dá)逐漸下降，72小時(shí)后Ngb表達(dá)恢復(fù)至正常。腦挫裂傷后6h及12h Ngb表達(dá)與對(duì)照組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05).
　　 2.在正常人血清中HSP60呈低表達(dá);腦挫裂傷后3小時(shí)血清中HSP60表達(dá)升高，直到72小時(shí)后才到峰值。腦挫裂傷后24h、48h及72h HSP60表達(dá)與對(duì)照組比較有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差

15、異(P＜0.05)。結(jié)論:本章實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)免疫印跡檢測(cè)腦挫裂傷患者血清中Ngb及HSP60的表達(dá)增強(qiáng)，與正常對(duì)照組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Ngb及HSP60在腦挫裂傷病理過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。
　　 綜上所述，本研究結(jié)論如下:
　　 本系列研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)及免疫組化、免疫印跡手段研究腦挫裂傷后人腦組織及血清中蛋白質(zhì)表達(dá)，得出如下結(jié)論:
　　 通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化、免疫印跡方法的研究，證明了Ngb和